基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的丹參酮IIA磺酸鈉調(diào)節(jié)主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化機(jī)制研究?

陳 芳，馬 飛，劉亞美，王 丹，沈曉君，魏 群

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450016)

老年性鈣化性瓣膜病嚴(yán)重危害人類健康，已成為心血管疾病的第三號殺手。老年性瓣膜病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]，目前認(rèn)為瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣改變是瓣膜鈣化的主要病因之一。尋找有效抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨樣變的藥物，延緩瓣膜鈣化進(jìn)展，是目前瓣膜病研究的熱點內(nèi)容之一[2-3]。因此，本文應(yīng)用丹參酮IIA磺酸鈉作用于瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs)，觀察其對間質(zhì)細(xì)胞的作用，探討其對間質(zhì)細(xì)胞成骨樣改變的深入機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

RPMI1640培養(yǎng)基，Solarbio公司；FBS胎牛血清，500 mL/瓶，美國Gibico公司；豬ELISA試劑盒(IL-6, IL-8)購自南京森貝伽公司，豬MCP-1 ELISA試劑盒購自genetex公司；Trizol 100 ml/瓶，Solarbio公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒，Transgen公司；免疫蛋白電泳及免疫熒光用一抗抗體 Runx2 (sc-10758, 兔抗人), osteocalcin(sc-30045, 兔抗人), β-actin(sc-130656兔抗豬)，美國Santa Cruz公司；α-SMA(兔抗豬)，武漢博士德，NCBI中檢索Runx2與osteocalcin蛋白，BLAST對比人與豬序列顯示物種同源性超過85%。二抗購買自武漢博士德，為羊抗兔IgG；茜素紅，北京索萊寶；丹參酮IIA磺酸鈉，上海遠(yuǎn)慕；牛黃熊去氧膽酸(TUDCA)杭州寶積；MTT細(xì)胞活力檢測試劑盒，北京百奧萊博，MCP-1中和抗體，美國R&D，其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Kendro公司)；StepOnePlus Realtime PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)；光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡(Olympus公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.3 豬瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs)培養(yǎng)、分組與藥物干預(yù)

成年健康新鮮豬屬家豬(Susscrofadomesticus)心分離主動脈瓣三瓣葉，浸泡于 1 mg/mL II 型膠原酶-DMEM 溶液, 37℃培養(yǎng)箱放置30 min，劇烈震蕩 1 min 分離內(nèi)皮后再將瓣葉置于新的 1 mg/mL II 型膠原酶-DMEM 溶液中, 37℃ 5% CO2培養(yǎng)4～6 h終止消化，離心后使用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)[4]。細(xì)胞豐度在80%左右，接種至6孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，更換培養(yǎng)基為成骨培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS濃度為10%～15%，10mmol/L β-甘油磷酸, 50 μg/ml 維生素C,100 nmol/L地塞米松的RPMI1640培養(yǎng)基)，參見參考文獻(xiàn)[5]，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行實驗。將各孔分為空白組、模型組、丹參酮IIA磺酸鈉組、西藥對照組(牛黃熊去氧膽酸，TUDCA)，每組均設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞饑餓后，除空白組外每組均使用100 mg/L oxLDL刺激，其余藥物oxLDL刺激24 h后依據(jù)時間截點加入，調(diào)整MCP-1中和抗體組濃度至5ug/ml，根據(jù)不同實驗?zāi)康陌磿r間收取檢測[4]。

1.4 丹參酮IIA磺酸鈉最佳刺激濃度的確定

取指數(shù)生長期的VICs細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為1×104/ml培養(yǎng)24 h后處理，模型組加入oxLDL，不同濃度的丹參酮IIA磺酸鈉組均加入oxLDL及相對應(yīng)濃度的丹參酮IIA磺酸鈉。MTT法檢測細(xì)胞活力及計算各組細(xì)胞存活率，選擇最佳的丹參酮IIA磺酸鈉干預(yù)濃度。

1.5 茜素紅染色

將傳代至第三代的VICs接種于事先放置潔凈蓋玻片的6孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片, 細(xì)胞融合率約為80% ～ 90%時換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并給予藥物干預(yù)，放置于37 ℃、5% CO2孵育, 14 d后茜素紅染色觀察成骨化程度[4,5]。

1.6 免疫印記實驗

成骨化培養(yǎng)基培養(yǎng)并藥物干預(yù)2周后，使用蛋白裂解液(碧云天)裂解VIC細(xì)胞并提取總蛋白后，4%～20% SDS - PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜PVDF膜，室溫封閉液封閉1 h后，一抗孵育過夜，一抗稀釋倍數(shù)按照對應(yīng)說明書進(jìn)行，Runx2(1∶1000)，osteocalcin(1∶500)，使用β-actin作為內(nèi)參。之后加入二抗洗滌，化學(xué)發(fā)光成像儀顯影并分析對應(yīng)條帶灰度值。

1.7 細(xì)胞總RNA提取及實時熒光定量PCR

用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，EP管中每管加入Trizol 1 ml室溫裂解5 min，之后逐步加入0.2 ml氯仿及異丙醇，分次離心并靜置；棄上清后75% 乙醇洗滌，高速離心；沉淀的RNA在自然干燥后用Rnase-free water 溶解。分光光度法檢測RNA純度及濃度。之后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入試劑，42 ℃孵育15 min，85℃5 s，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光定量分析。實時熒光定量仍采用Transgen公司產(chǎn)品，從NCBI中選取家豬(Susscrofadomesticus)對應(yīng)蛋白的mRNA序列外顯子部分，PrimerPremier 6.0設(shè)計引物，primer-blast比對引物序列，最終設(shè)計豬特異性引物序列如表1[5-6]，應(yīng)用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列表

1.8 酶聯(lián)免疫吸附實驗

細(xì)胞培養(yǎng)后取其上清液，按照說明書進(jìn)行如下操作：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，設(shè)置樣品孔、空白孔等，封板膜封口后孵育，反復(fù)洗滌5次后棄洗滌液加入酶標(biāo)試劑，再次孵育洗滌后加入A、B顯色液及終止液，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度并最終計算濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 豬主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

圖1顯示，分離培養(yǎng)的豬主動脈瓣瓣膜間質(zhì)細(xì)胞呈梭形，單層排列，成漩渦狀或放射狀聚集，生長較緩慢，免疫熒光染色顯示約70%的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，α-SMA染色陽性，提示造模成功。

2.2 丹參酮IIA磺酸鈉最佳刺激濃度的確定

應(yīng)用oxLDL造模，給予不同濃度丹參酮IIA磺酸鈉干預(yù)后，根據(jù)公式計算細(xì)胞活力(%)=(A藥物-A空白) / (A模型-A空白) × 100%。表2顯示，丹參酮IIA磺酸鈉刺激濃度在50 μg/ml時進(jìn)入平臺期，故最終選擇50 μg/ml為下述實驗刺激濃度。

表2 MTT法對細(xì)胞活力的檢測及最佳藥物濃度選擇

圖1 豬主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定注：左圖為光鏡下主動脈間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(×100)，右圖為熒光顯微鏡α-SMA染色結(jié)果(×400),光鏡下可見豬主動脈瓣瓣膜間質(zhì)細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞為梭形，成漩渦狀或放射狀排列，箭頭處為典型梭形生長的細(xì)胞，熒光顯微鏡顯示表達(dá)α-SMA細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，見箭頭所指處，約70%的細(xì)胞表達(dá)α-SMA，提示造模成功

2.3 茜素紅染色及western-blot檢測成骨化結(jié)果

圖2、3表3顯示，染色結(jié)果提示oxLDL誘導(dǎo)VICs細(xì)胞成骨化，顯微鏡下可見多個鈣化結(jié)節(jié)形成，丹參酮IIA磺酸鈉可減輕鈣化結(jié)節(jié)形成，減輕程度與西藥對照組類似。western-blot提示，模型組在oxLDL誘導(dǎo)下Runx2及osteocalcin蛋白表達(dá)明顯升高，提示VIC細(xì)胞出現(xiàn)成骨化，而丹參酮IIA磺酸鈉可減輕成骨化蛋白表達(dá)(P<0.05)，與茜素紅染色結(jié)果相一致。

2.4 實時熒光定量定量PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細(xì)胞上清液中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)炎癥因子

表4顯示，實時熒光定量PCR檢測培養(yǎng)的VIC細(xì)胞BIP，Chop蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組在oxLDL誘導(dǎo)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急蛋白標(biāo)志物mRNA表達(dá)明顯升高，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，而丹參酮IIA磺酸鈉可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及IL-6，IL-8及MCP-1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。

圖2 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果(×100)注：a.空白組；b.模型組；c.丹參酮IIA磺酸鈉組；d.西藥對照組；圖中橘紅色結(jié)節(jié)即為鈣化結(jié)節(jié)，如箭頭所示，可見丹參酮IIA磺酸鈉組減輕鈣化結(jié)節(jié)的生成

圖3 western blot檢測成骨化相關(guān)蛋白runx2及osteocalcin表達(dá)注：a.空白組；b.模型組；c.丹參酮IIA磺酸鈉低劑量組(10 μg/ml)；d.丹參酮IIA磺酸鈉高劑量組(50 μg/ml)；e.西藥對照組

表3 成骨化相關(guān)蛋白runx2及osteocalcin相對表達(dá)量

注：與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

表4 BIP及CHOP mRNA檢測及酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測ERS相關(guān)炎癥因子表達(dá)結(jié)果

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

圖4 Wester-blot檢測MCP-1中和抗體對VICs成骨化的影響注：a.空白組；b.模型組；c.MCP-1中和抗體組

2.5 western-blot檢測應(yīng)用MCP-1中和抗體后成骨化相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4、表5顯示，oxLDL誘導(dǎo)VICs后，Runx2及osteocalcin蛋白表達(dá)明顯升高，而在oxLDL誘導(dǎo)后24 h加入MCP-1中和抗體孵育24 h，Runx2及osteocalcin蛋白表達(dá)僅略降低，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 MCP-1中和抗體對runx2及osteocalcin相對表達(dá)量的影響

注：與空白組比較：*P<0.05

3 討論

老年性鈣化性瓣膜病以主動脈受累多見，簡稱鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)，又稱主動脈退行性變，是一組以瓣膜結(jié)締組織發(fā)生纖維化和鈣化, 導(dǎo)致瓣葉出現(xiàn)局部增厚、活動受限及啟閉功能障礙的老年性退行性疾病[1-4]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，CAVD發(fā)生發(fā)展過程是被動性的鈣磷沉積過程，隨年齡增長而進(jìn)行性加重。而近年來研究表明，主動脈瓣鈣化性疾病及其類似于動脈粥樣硬化，是一組多細(xì)胞、多基因、多靶點調(diào)控的主動性過程，早期出現(xiàn)脂質(zhì)沉積、致粥樣硬化特征性的泡沫樣巨噬細(xì)胞及少量T淋巴細(xì)胞浸潤為主，病變進(jìn)展期隨著瓣膜內(nèi)鈣鹽沉積量增多，逐漸演變?yōu)榘昴て髻|(zhì)性變，瓣膜僵硬及開閉功能障礙[2-3,6]。因此，主動脈瓣鈣化在此病中發(fā)揮著舉足輕重的作用。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs)是瓣膜中主要存在的兩種細(xì)胞類型之一, 是主動脈瓣膜鈣化最主要的參與細(xì)胞。VICs細(xì)胞成骨樣變在老年性CAVD發(fā)生發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位,導(dǎo)致VICs成骨樣變的因素復(fù)雜，目前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是有證據(jù)的導(dǎo)致其成骨化最主要的原因之一[1]。

丹參酮IIA磺酸鈉是中藥丹參活性成分丹參酮IIA的一系列磺基化衍生物，臨床上廣泛應(yīng)用于心絞痛及室性早搏的治療[6-7]。同時該藥物還被發(fā)現(xiàn)可改善微循環(huán)，減輕缺血再灌注損傷，抗炎及抗血小板作用[7]。實驗數(shù)據(jù)表明，丹參酮IIA磺酸鈉可改善血管平滑肌細(xì)胞異常增殖及鈣化，而血管平滑肌細(xì)胞與VICs高度類似，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激亦參與血管平滑肌細(xì)胞異常鈣化途徑，丹參及其提取物可減緩上述過程[7]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工及合成的生物工廠，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用。缺氧、應(yīng)激或各種不良理化條件刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)(UPR) 和 Ca2 +平衡失調(diào)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。ERS 反應(yīng)是真核細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞借此恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)維持生存。但過強(qiáng)或者長時間的 ERS 反應(yīng)對細(xì)胞弊大于利，可引起細(xì)胞的損害甚至死亡[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與多種心血管相關(guān)疾病研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化過程，應(yīng)用特異性抑制劑TUDCA處理后，大鼠主動脈瓣鈣化程度減輕[10]，并且oxLDL通過IRE-1α/C-Jun誘導(dǎo)離體主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而使間質(zhì)細(xì)胞鈣化[11-12]。課題組的研究結(jié)果亦表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激確實參與主動脈瓣膜鈣化進(jìn)程，可影響VICs細(xì)胞成骨樣變，而丹參酮IIA磺酸鈉組可逆轉(zhuǎn)主動脈瓣鈣化進(jìn)程，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要標(biāo)記蛋白BIP，CHOP mRNA表達(dá)減輕瓣膜間質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制成骨化相關(guān)蛋白runx2及osteocalcin表達(dá)，從而減輕主動脈瓣鈣化，但同時課題組也發(fā)現(xiàn)，單純抑制炎癥因子MCP-1，對成骨化相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控作用并不理想，這可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活多條炎癥通路，單一通路的影響作用較小有一定關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，丹參酮IIA磺酸鈉可減輕瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨化相關(guān)蛋白及炎癥因子表達(dá)，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激減輕細(xì)胞損害，發(fā)揮延緩瓣膜間質(zhì)鈣化的作用。