益氣養(yǎng)陰固沖方及其拆方對(duì)無排卵性功血?dú)怅巸商撟C大鼠子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1的影響?

包紅桃，王 婷，武權(quán)生

(1.蘭州市第一人民醫(yī)院,蘭州 730050；2.臨洮縣中醫(yī)院,甘肅 定西 730500；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

無排卵性功血是因調(diào)節(jié)生殖的下丘腦-垂體-卵巢軸神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂而出現(xiàn)的臨床婦科常見病，患者往往會(huì)有貧血、感染、不孕等，甚至對(duì)婦女的身心健康、生活質(zhì)量造成很大的影響，還為患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。此外，子宮內(nèi)膜增生過厚在一定條件下還有轉(zhuǎn)變?yōu)樽訉m內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)，后期病情嚴(yán)重時(shí)甚則會(huì)引發(fā)失血性休克。目前，西醫(yī)治療以藥物(激素藥和促排卵藥)和手術(shù)為主，其治療效果、預(yù)后及安全性方面仍然存在不足之處，而傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療具有經(jīng)濟(jì)安全、療效穩(wěn)定、維持時(shí)間長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率低、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)和特色。長(zhǎng)期從事中西醫(yī)婦產(chǎn)科教學(xué)、臨床、科研工作的武權(quán)生教授，在臨床經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)出治療功血的臨床經(jīng)驗(yàn)方益氣養(yǎng)陰固沖方，在治療氣陰兩虛證型無排卵性功血過程中具有顯著的中醫(yī)治療特色。故本實(shí)驗(yàn)造模通過病證結(jié)合方法，觀察臨床經(jīng)驗(yàn)方益氣養(yǎng)陰固沖方對(duì)氣陰兩虛證型無排卵性功血大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度探討無排卵性功血的發(fā)病機(jī)制，并從益氣養(yǎng)陰固沖方及其各組拆方治療該病的藥物機(jī)理進(jìn)行研究，并依此優(yōu)化組方，發(fā)揮中醫(yī)藥治療該病的優(yōu)勢(shì)和特色，旨在為該方的臨床應(yīng)用提供一定價(jià)值和社會(huì)意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20) g，3～4月齡，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供(動(dòng)物批號(hào)SCXK(甘)2011-0001-0000613)。

1.2 藥物及試劑

補(bǔ)佳樂(戊酸雌二醇片)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司(批號(hào)J20080036)；氫化可的松注射液，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司(批號(hào)H20023069)；中藥由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，中藥水煎后過濾合并2次藥液，濃縮成相當(dāng)于原生藥材2 g/ml的藥液，冷卻裝入消毒的空瓶，置于4 ℃冰箱備用；益氣養(yǎng)陰固沖方組成：黃芪30 g，黨參15 g，炒山藥15 g，煅龍骨30 g，煅牡蠣30 g，海螵蛸12 g，炒地榆15 g，茜草炭10 g，血余炭10 g，旱蓮草15 g，仙鶴草15 g，炒蒲黃15 g，生地15 g，白芍15 g，杜仲15 g，炙甘草6 g。益氣組：黃芪30 g，黨參15 g，炒山藥15 g，海螵蛸12 g。固沖組：炒蒲黃15 g，茜草炭10 g，血余炭10 g，仙鶴草15 g，炒地榆15 g。養(yǎng)陰組：生地15 g，白芍15 g，旱蓮草15 g，煅龍骨30 g，煅牡蠣30 g。陽性對(duì)照藥宮血寧膠囊，云南白藥集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)Z20020087)；SP法免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟，BI-2000型；拍照設(shè)備，山東易創(chuàng)MIE圖像處理系統(tǒng)；光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS，CX21X型；恒控磁力攪拌器，HKCB-3型，溫州市醫(yī)療電器廠；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，美國(guó)AO-82型；電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械廠；隔水式電熱培養(yǎng)箱，PYX-PHS-B型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電子天平，ES-1000E型，長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 造模

SPF級(jí)SD雌性大鼠70只，隨機(jī)分出1組(5只)行假手術(shù)，每日正常喂食，并給予生理鹽水灌胃作為空白對(duì)照組，其余大鼠行雙側(cè)卵巢去勢(shì)手術(shù)[3]。

2.2 分組及給藥

行卵巢去勢(shì)術(shù)后第7天，待傷口愈合后使大鼠每日饑餓、疲勞游泳[4]；模型組同步灌胃給予補(bǔ)佳樂溶液1 ml/100 g，空白對(duì)照組連續(xù)灌胃14 d生理鹽水1 ml/100 g。模型組在灌胃補(bǔ)佳樂第11天起時(shí)用“氫考型陰虛造模法。[5]”每只大鼠于每日17∶00連續(xù)灌服4 d 5 mg/mL氫化可的松注射液(劑量按50 mg/kg計(jì)算)。其余大鼠在補(bǔ)佳樂灌胃第15天起時(shí)按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、宮血寧組、益氣組、固沖組、養(yǎng)陰組、全方組各5只，而后各組灌胃相應(yīng)的不同藥物，其劑量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量給藥：dB(mg/kg)=dA×KB/KA[6]，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組連續(xù)5 d灌服生理鹽水。

2.3 檢測(cè)方法

末次灌胃給藥40 min后大鼠稱重脫頸處死，摘取子宮生理鹽水沖洗，洗去血液用濾紙吸干，然后用10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切片后脫蠟至水，采用免疫組化S-P法試劑盒檢測(cè)子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平。MMP-9、TIMP-1[7]的免疫組化染色強(qiáng)度通過圖像分析系統(tǒng)定量分析，彩色圖像分析儀測(cè)定的灰度數(shù)值可作為免疫組化片陽性區(qū)域表達(dá)的定量指標(biāo)[8-9]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

表1顯示，在MMP-9及TIMP-1的灰度值中，模型對(duì)照組MMP-9表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，而TIMP-1表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，各用藥組MMP-9、TIMP-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，固沖組、養(yǎng)陰組及益氣組MMP-9表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，固沖組、養(yǎng)陰組TIMP-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與宮血寧組比較，固沖組和養(yǎng)陰組MMP-9及TIMP-1表達(dá)均有所降低(P<0.05)，益氣組和全方組MMP-9表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而益氣組和全方組TIMP-1表達(dá)顯著降低(P<0.05)；MMP-9/TIMP-1的比值中，全方組的比值是1，其次是宮血寧組，益氣組次于前2組。

表1 益氣養(yǎng)陰固沖方及其拆方對(duì)子宮內(nèi)膜MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較：△P<0.05，△△P<0.01；▲與宮血寧組比較：P<0.05

圖1 光鏡下大鼠子宮內(nèi)膜MMP-9免疫組化染色(40×)注：A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.宮血寧組；D.益氣組；E.固沖組；F.養(yǎng)陰組；G.全方組

圖2 光鏡下大鼠子宮內(nèi)膜TIMP-1免疫組化染色(40×)注：A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.宮血寧組；D.益氣組；E.固沖組；F.養(yǎng)陰組；G.全方組

4 討論

育齡期婦女經(jīng)歷不同的周期性變化時(shí)，MMPs在其子宮內(nèi)膜周期性增殖和脫落過程中發(fā)揮舉足輕重的作用。MMPs是一組有鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族，在生化性能方面有著共同點(diǎn)，可使細(xì)胞外基質(zhì)(ext racellular matrix, ECM) 有所降解，根據(jù)降解產(chǎn)物的不同可將其分為4型大約20 種[10]。MMP-9[11]是家族中分子量最大的明膠酶，在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中可以檢測(cè)到，尤其在月經(jīng)期和分泌期表達(dá)至最強(qiáng)。TIMP-1[12-13]是MMP-9的天然抑制劑，二者由同一細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可與活化的MMP-9鋅離子位點(diǎn)等量相結(jié)合，從而抑制MMP-9的生化活性，進(jìn)一步參與調(diào)節(jié)ECM的降解過程。MMP-9、TIMP-1主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，但在間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中則相對(duì)較少。

相關(guān)資料顯示，維持正常ECM的降解和重建，理論上MMP-9/TIMP-1的比值需接近于1則可。而ECM[14]包括纖維黏連蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)和膠原蛋白等。ECM和血管基底膜的主要成分為IV型膠原，可黏合在血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，隨著月經(jīng)周期的變化，其含量也有所不同，能促進(jìn)其在基底膜的黏附，對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞起到支持作用，有助于血管的生成及其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，還可結(jié)合整合素來穩(wěn)固細(xì)胞彼此的黏合[15]。Galant[16]等在研究功血與MMP表達(dá)和活化的之間的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)不規(guī)則子宮出血患者出血期MMP-9含量顯著升高，而TIMP-1水平則顯著下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠的子宮內(nèi)膜組織MMP-9表達(dá)水平有所降低，TIMP-1水平表達(dá)有所升高，從而使子宮內(nèi)膜增厚甚則發(fā)生無排卵性功血，同時(shí)也從另一個(gè)方面說明本實(shí)驗(yàn)中無排卵性功血的動(dòng)物模型制備成功。應(yīng)用陽性對(duì)照藥物宮血寧、益氣養(yǎng)陰固沖方全方及各拆方組藥物治療后，各治療組MMP-9表達(dá)水平升高，TIMP-1水平表達(dá)下降，而以全方組和益氣組改變更為明顯。說明益氣養(yǎng)陰固沖方全方組藥物的治療效果優(yōu)于宮血寧組，而益氣組藥物的治療療效較全方組藥物明顯，且二者在功效上有相似之處。

MMP/TIMP的比值接近1則能維持正常細(xì)胞外基質(zhì)降解和重建的功能，可以促進(jìn)血管的形成并穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，MMP、TIMP是一個(gè)平衡組對(duì)，在本實(shí)驗(yàn)中，全方組兩者的比值最接近1，宮血寧組次之，而后是益氣組，說明益氣組對(duì)于血管內(nèi)皮的修復(fù)作用要優(yōu)于其他各組，也說明方中君藥益氣組可益氣生津、止血養(yǎng)血，益氣養(yǎng)陰固沖全方對(duì)血管生成有促進(jìn)作用，從而促進(jìn)功血患者子宮內(nèi)膜的修復(fù)，可有效維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，治療氣陰兩虛證型的無排卵性功血。