分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定禽蛋中4 種內外源性孕激素

黃麗英，鄒 圓，陸 強，范棟杰，顧 捷，龍 舉，張月星,*

孕激素是一類由卵巢黃體細胞分泌維持妊娠所必需的的二十一碳類固醇激素，主要以孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮等為主，長時間食用含有孕激素的食品可能產生惡心、頭痛、月經紊亂、卵巢腫大等問題[1]。禽蛋又名禽卵，是家禽所產的卵，富含卵磷脂、固醇類、多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質，是一種營養(yǎng)價值較高的方便膳食補充來源[2-3]。禽蛋類食物本身含有內源性孕酮，其食用健康安全性尤其對兒童發(fā)育的影響備受關注，但鮮見有相關研究資料表明禽蛋天然內源性孕酮與食品安全有關，同時飼養(yǎng)過程中使用外源性激素（如醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）對禽蛋中內源性激素含量變化的影響也不明晰，而且禽蛋中相關的國家食品標準亦沒有對孕激素進行限量的規(guī)定[4]。因此有必要建立準確、高效的禽蛋中孕激素的檢測方法，利于掌握和分析禽蛋中內外源性孕激素含量，為開展禽蛋中孕激素的安全性評價提供可靠的分析測定依據，對保障農產品安全具有現實意義。

目前激素的檢測多集中在β激動劑[5]、糖皮質激素[6]方面，而且主要在環(huán)境水體[7-8]、化妝品[9]、生物樣品[10-11]方面，其中最常用的方法為液相色譜法[12]、氣相色譜-質譜法[13]、液相色譜-串聯質譜法[14]等，其中液相色譜法抗干擾能力較弱，氣相色譜-質譜法需要衍生化，大多應用于環(huán)境中的雌激素檢測，液相色譜-串聯質譜法具有定性能力強、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛地應用于食品領域。Yang Yi[15]、Wang Quanlin[16]等建立了禽蛋中性激素的液相色譜-串聯質譜法，但禽蛋中4 種孕激素同時測定的方法鮮見報道。國家也陸續(xù)發(fā)布了相關標準[17]，GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》對動物源性食品中的激素進行多殘留檢測，因該標準是在特定背景下推出，標準推出時間倉促，涉及范圍太廣，采用雙柱聯合的方式回收率不甚理想[18-19]。分散固相萃取技術是在提取液中直接加入吸附劑粉末進行凈化，由Lehotay[20]和Anastassiades[21]提出的一種快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的前處理技術QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe），最早在農藥多殘留中使用，近年來已越來越多的應用于藥物殘留檢測[22-28]。先進的QuEChERS樣品預處理技術目前也逐漸應用于禽蛋中各種硝基咪唑類、氯霉素等抗生素檢測[29-30]。本實驗采用分散固相萃取進行樣品凈化，運用超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術，建立了禽蛋中4 種孕激素同時檢測的方法。實驗使用正己烷提取，成功解決了蛋白質變性結塊從而包裹目標物的問題，同時借鑒國際上通用的分散固相萃取技術在凈化過程中利用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）固相吸附劑有效除去了蛋黃素、卵磷脂等后期氮吹對目標物回收率產生影響的物質，極大提高了回收率，拓展了分散固相萃取技術在禽蛋中激素檢測領域的新應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、正已烷（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；C18和弗羅里硅土上海安譜科學儀器有限公司；PSA 美國Sigma公司。

雌性激素標準物質：孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；同位素：孕酮-D9內標 加拿大C/D/N ISOTOPES公司。

分別稱取10 mg各標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL的儲備液，并密封貯存于-20 ℃冰箱中。使用時用流動相或基質提取液將混合標準溶液稀釋成一系列質量濃度的標準溶液，待測。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTMUPLC儀、XEVO TQ-MS MS/MS儀 美國Waters公司；WH-861渦旋混合器 太倉華利達實驗設備有限公司；ZHWY-110X往復式恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制作有限公司；HGC-36A氮吹儀天津市恒奧科技有限公司；BIOFUGE STRATOS高速冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

為獲取較高靈敏度，采用注射泵連續(xù)進樣方式對4 種標準物質和1 種內標物的質譜參數包括檢測離子對、錐孔電壓、碰撞能量等進行自動調諧優(yōu)化。其他質譜條件：孕激素采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正離子模式；毛細管電壓：3.0 kV（＋）；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；碰撞池壓力：3.0×10-3mbar。

1.3.2 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離。柱溫為35 ℃，樣品溫度為25 ℃，進樣體積為5 μL，流速為0.2 mL/min。根據激素的化學性質，選擇甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液3 種不同流動相對色譜峰的峰形以及分離效果進行優(yōu)化。最終選取流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇。梯度洗脫：0～1.5 min，30% B；1.5～4.0 min，30%～80% B；4.0～5.0 min，80% B；5.0～5.5 min，80%～30% B；5.5～8.0 min，30% B。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 提取

將新鮮禽蛋打碎攪拌均勻后稱取樣品2.0 g于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋3 min，振搖10 min，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min后，取上清液至玻璃管中。再用10 mL的正己烷重復提取一次，合并上層有機液，在45 ℃氮氣吹干，待凈化。在提取條件優(yōu)化的過程中，主要對乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇和正己烷5 種提取溶劑，振蕩提取法、均質提取法以及超聲提取法3 種提取方式的提取效率進行回收率實驗比較。

1.3.3.2 凈化

加入1 mL的甲醇-水（1∶1，V/V）復溶殘渣，倒入裝有50 mg PSA的2 mL高速離心管中，振搖10 min，放入冰箱－20 ℃冷凍靜置10 min后，以14 000 r/min離心10 min，取澄清液經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。在凈化條件優(yōu)化的過程中，考察弗羅里硅土、PSA和C18不同吸附劑種類和用量對凈化目標化合物的影響。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進樣進行孕激素的分析，孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和孕酮-D9共5 種標準品采用ESI＋離子化模式，對標準溶液分別進行全掃描，對毛細管電壓、錐孔電壓進行充分的優(yōu)化，確定準分子離子峰。再使用子離子掃描方式，調節(jié)碰撞能量，分別選取經碰撞后所得豐度較高、碎片結構合理的兩個子離子作為定量和定性離子，并優(yōu)化其最佳碰撞能量。最終確定的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動相同時分析4 種孕激素的分離效果，發(fā)現乙腈-水并不能使這4 種離子完成出峰，而甲醇-水可以使醋酸甲地孕酮、醋酸美倫孕酮、醋酸氯地孕酮、孕酮4 種孕激素分離出峰，但4 種孕激素則峰形很差。為了提高孕激素化合物的離子化效率，在水相中加入0.1%甲酸，各激素的峰形和靈敏度有了較大改善。因此分別采用甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相分析4 種孕激素，圖1為ESI＋離子化模式下4 種孕激素標準溶液的MRM色譜圖。

圖1 ESI+離子化模式下4 種孕激素標準溶液的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of standard solutions of progesterone hormones under ESI+ mode

2.3 前處理技術的優(yōu)化

2.3.1 提取方式的選擇

實驗對振蕩提取法、均質提取法以及超聲提取法在提取禽蛋中孕激素的效果進行了比較。選取3 組樣品，每組加入相同的標準混合溶液后加入等量的提取溶劑，第1組采取振蕩提取法，時間10 min；第2組采用均質提取法，時間10 min；第3組采用超聲波提取法，時間10 min。其他處理步驟如1.3節(jié)，結果如表2所示。

表2 3 種不同提取方式的回收率比較Table 2 Comparison of recoveries of three different extraction methods

從表2可以看出，振蕩提取效果最好，其次是均質提取，最差的為超聲提取。這可能是禽蛋樣品蛋白質含量比較高，樣品比較黏稠，聲波空化作用導致部分蛋白質分散，加大了對目標化合物的包裹，所以選取振蕩提取方式作為本實驗樣品的提取方式。

2.3.2 提取液的選擇

孕激素類化合物的極性一般表現為較弱或者中等，提取溶劑常用的有乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷等。實驗分別選取了乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、正己烷作為提取溶劑進行比較，效果見圖2?？紤]到禽蛋中含有大量的卵磷脂和腦磷脂，直接用乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取，提取液中會形成較多的白色稠狀物，影響凈化結果。結合振蕩提取方式，考察乙腈、甲醇等不同提取溶劑的提取效率，發(fā)現使用乙腈與甲醇提取立刻使蛋白質變性，形成大的顆粒狀物質，對目標物進行包裹，極大地降低了回收率，并且禽蛋中的蛋黃素會被乙腈和甲醇提取出，氮吹時這些蛋黃素等物質也會把目標物包裹。使用正己烷提取，禽蛋中的蛋白質在正己烷中并不結塊，且呈現分散狀，故很好地解決因蛋白質變性對目標物包裹問題，其次實驗用正己烷提取，可以省去無水硫酸鎂除水步驟，既節(jié)省了時間又減少了吸附性損失。

圖2 不同提取溶劑對4 種孕激素提取效率的影響Fig. 2 Effects of different solvents on the extraction efficiency of 4 progesterone hormones

2.3.3 分散固相萃取條件的選擇與優(yōu)化

2.3.3.1 吸附劑種類的選擇

本實驗采用分散固相萃取進行凈化，分別對弗羅里硅土、PSA和C18進行了比較。結果表明，弗羅里硅土是一種強極性吸附劑，對基質液中的脂類、糖類沒有凈化作用；PSA和C18能除去基質中的脂肪酸和糖類物質，但同時C18對孕激素吸附比較大，導致提取率下降，而PSA對孕激素吸附作用小，故選擇PSA作為吸附劑，見圖3。

圖3 分散劑對4 種孕激素的吸附能力Fig. 3 Adsorption capacity of dispersant toward 4 progesterone hormones

2.3.3.2 吸附劑用量的優(yōu)化

實驗考察30、40、50、60、70、80、90 mg等不同質量的PSA對4 種孕激素的凈化效果，如圖4所示。當PSA為30 mg時，4 種孕激素的回收率為107.3%～140.1%，這一方面可能是禽蛋中自帶的孕激素對回收率的影響，另一方面可能是禽蛋樣品中未被除去基質干擾物對目標分子具有基質增強作用。當PSA含量為50～60 mg時，除孕酮外的3種孕激素的回收率為92.8%～99.0%。當PSA的用量進一步增加時，致使回收率降低，可能是PSA中的—NH2與孕激素的羰基發(fā)生氫鍵作用的幾率增加。綜上所述，選擇吸附劑用量為50 mg。

圖4 不同質量的PSA對4 種孕激素的凈化效果Fig. 4 Purification efficiency of different amounts of PSA for 4 progesterone hormones

2.3.3.3 富集后處理的優(yōu)化

實驗改變了一般QuEChERS方法的凈化步驟，改成氮吹定容后再凈化，一方面提高了PSA的利用率，避免了小質量凈化顆粒對大體積試劑凈化效果不佳的影響，另一方面避開了一般QuEChERS方法部分提取不均對濃度折算的誤差。此外，冷凍10 min后離心，能有效去除去小部分的油脂，達到低溫脫脂的效果。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系、檢出限和定量限

用除含孕酮外的3 種孕激素含量均低于檢出限的禽蛋作為基質樣品，經前處理得到樣品基質液，用基質提取液配制醋酸美倫孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮的混合標準溶液，以目標化合物的峰面積（y）對其相應的質量濃度（x）分別繪制外標標準曲線。孕酮用流動相配制0.4～100 μg/L范圍的一系列標準溶液，各點內標質量濃度均為10 μg/L，繪制內標法校準曲線。4 種孕激素具有良好的線性關系，相關系數r2均大于0.996。根據3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，具體見表3。

表3 4 種孕激素的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection,and limits of quantitation for 4 hormones

2.4.2 回收率和精密度實驗結果

分別在已知孕酮含量的禽蛋樣品中添加3 種不同水平的4 種孕激素混合標準溶液，按1.3節(jié)方法進行預處理，每個水平重復測定6 次，分別計算平均回收率和相對標準偏差，具體見表4?？梢钥闯? 種加標水平下，醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸美倫孕酮和孕酮4 種孕激素的回收率分別為85.7%～99.7%、86.4%～96.8%、85.3%～94.5%、79.5%～88.6%；相對標準偏差分別為4.2%～9.5%、1.4%～4.5%、3.8%～5.7%、2.3%～4.7%，可以滿足日常樣品分析要求。

表4 禽蛋中4 種孕激素的加標回收率與相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 4 progesterone hormones in spiked egg (n = 6)

2.5 實際樣品分析和確證

對從超市、菜場購買的36 批次禽蛋進行測定，禽蛋試樣中MRM離子流色譜圖如圖5所示，孕酮處有明顯的色譜峰，應為內源性孕酮，孕酮的含量在5～65 μg/kg之間。為了驗證本方法的準確性，用離子阱飛行時間質譜通過多級質譜圖進行分析，對孕酮陽性樣品進行了確證。圖6為禽蛋中檢出的孕酮三級質譜圖，與標準品的多級質譜圖母離子（m/z 315.232 7）、二級子離子（m/z 297.220 0）以及三級子離子（m/z 203.434 0）的質量數偏差分別為－3.9、－0.1、0.5 mDa，可以準確地對該樣品進行定性分析。

圖5 雞蛋樣品孕酮和孕酮內標提取離子流圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of egg samples and internal standard

圖6 雞蛋樣品中孕酮的三級質譜圖Fig. 6 Mass spectra of positive egg samples

3 結 論

本實驗采用分散固相萃取-UPLC-MS/MS技術建立了同時檢測禽蛋中4 種孕激素的分析方法，通過儀器條件、提取溶劑和方式、吸附劑種類和用量方面的優(yōu)化考察，方法的檢出限為0.2 μg/kg，回收率在79.5%～99.7%之間，方法學評價表明該方法靈敏度高、回收率好。尤其使用正己烷作為提取溶劑并結合振蕩提取法，可避免禽蛋中蛋白質變性對目標分析物進行包裹的現象從而提升測定的回收率。同時在凈化過程中使用PSA吸附劑有效除去了禽蛋中蛋黃素、卵磷脂等后期氮吹對目標物回收率產生影響的物質，重復性好，相對標準偏差均小于10%。相比GB/T 21981—2008雙柱聯合凈化，該方法簡化了實驗過程，提高了凈化效率和凈化速度，縮短了分析時間。本方法還通過離子阱飛行時間質譜多級質譜分析功能，對孕酮陽性樣品進行了確證。優(yōu)化后正己烷提取、PSA凈化的UPLC-MS/MS測試方法操作簡便、靈敏度高、實用性強，其回收率及重復性能滿足日常檢測的要求。