不同水解度豬骨蛋白水解物對(duì)水包油型乳狀液乳化特性的影響

劉昊天，李媛媛，汪海棠，孔保華*

乳狀液是由一種液體以液滴的方式分散在另一種與其不相溶的液體中所組成的非均相體系[1]。乳狀液一般分為水包油（O/W）與油包水（W/O）兩種類型，這兩種類型的乳狀液被廣泛的應(yīng)用于化妝品、護(hù)膚品，以及制藥業(yè)，但前者在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的更為廣泛[2]。乳狀液一經(jīng)形成，隨后在預(yù)期的貨架期內(nèi)使其保持穩(wěn)定是至關(guān)重要的。乳狀液的分層，絮凝和聚集等機(jī)制都會(huì)對(duì)乳化體系的穩(wěn)定性造成破壞[3]。而許多蛋白質(zhì)是表面活性物質(zhì)，可以作為乳化劑應(yīng)用于乳狀液的制備中，因?yàn)樵谄涠嚯逆溕虾性S多具有親水性和疏水性的氨基酸，它們可以吸附到油水界面上并包裹由均質(zhì)化所形成的油滴[4]。同時(shí)因?yàn)樗鼈兒袔ж?fù)電（—COO-）以及帶正電荷（—NH3＋）的氨基酸，因此可以產(chǎn)生靜電斥力，起到穩(wěn)定液滴、防止聚集的作用[5]。

動(dòng)物鮮骨是畜禽屠宰加工中主要的副產(chǎn)品，約占胴體的10%～15%[6]。鮮骨中含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、磷蛋白和磷脂質(zhì)等，蛋白質(zhì)約占總體營(yíng)養(yǎng)成分的11%～15%，其中90%為骨膠原及軟骨素。我國(guó)是畜肉生產(chǎn)大國(guó)，以往的加工過程中主要對(duì)象是肉類，而其副產(chǎn)物往往被忽視，大量的畜禽骨骼得不到利用或者加工產(chǎn)品價(jià)值低，從而使得資源浪費(fèi)并造成了一定的環(huán)境壓力。國(guó)內(nèi)外針對(duì)畜禽骨骼的加工主要是將其制成骨粉用作動(dòng)物飼料，以及提取營(yíng)養(yǎng)元素應(yīng)用于保健食品中，此外，近年來有利用骨蛋白酶解產(chǎn)物制備功能性多肽的研究。酶法水解條件溫和，通過酶水解可以提高蛋白質(zhì)的溶解度并使其位于內(nèi)部的功能性基團(tuán)更好地暴露出來。刁靜靜等[7]研究表明通過酶解處理可將短時(shí)間加熱處理或一般加工溫度難以利用的骨膠原蛋白水解成多肽及L-氨基酸以此來提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。劉騫等[8]對(duì)不同水解度的豬血漿蛋白的抗氧化能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明豬血漿蛋白水解物的抗氧化能力隨著水解度的提高而顯著增強(qiáng)，Xu Xingfeng等[9]的研究發(fā)現(xiàn)水解天然谷蛋白會(huì)改善其乳化活性（emulsion activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index，ESI），并且適度水解的谷蛋白水解物具有最高的物理穩(wěn)定性。李媛媛等[10]利用堿性蛋白酶對(duì)玉米蛋白進(jìn)行水解，探討了水解后玉米蛋白乳化能力及抗氧化能力提高的機(jī)制，為制備乳化能力高且具有一定抗氧化能力的玉米蛋白水解物提供一定的理論參考依據(jù)。

目前，現(xiàn)有關(guān)于酶水解的研究主要集中在單相（溶液）體系中，缺乏在多相體系中的深入探討，因此本實(shí)驗(yàn)以不同水解時(shí)間為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)不同水解度的豬骨蛋白水解物（porcine bone protein hydrolysates，PBPH）在乳化體系中的作用機(jī)理進(jìn)行探討，優(yōu)化出可以應(yīng)用于乳狀液體系中的PBPH乳化性的平衡點(diǎn)，探討不同水解度的PBPH增強(qiáng)乳化性的作用機(jī)制，以此提高豬骨蛋白利用價(jià)值并為后續(xù)其在乳化體系中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬腿骨 北大荒肉業(yè)有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 丹麥Novo公司；鄰苯二酚紫、菲啰嗪、Ans-熒光探針 美國(guó)Sigma公司；九三一級(jí)大豆色拉油九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；過硫酸鉀、鹽酸、亞硫酸鈉、氯化亞鐵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、3%過氧化氫等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20K型pH計(jì)、AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器上海雷磁新徑儀器有限公司；722可見光分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠；XW-80A渦旋混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；FD-2A冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬骨蛋白的制備

剔除豬腿骨上的非骨物質(zhì)（肉、皮、骨膜等），將骨骼粉碎至1～2 cm3，在室溫下將骨碎片以10%的比例置于0.6 mol/L鹽酸溶液中浸泡24 h以除去鈣、磷等有機(jī)成分，浸泡結(jié)束后用自來水沖洗骨碎片，再將骨碎片移至0.1%的氫氧化鈣中浸泡至骨碎片呈現(xiàn)潔白色時(shí)，用稀鹽酸將骨碎片pH值調(diào)節(jié)至7，再用清水清洗除去雜質(zhì)，將處理過的骨碎片在90 ℃煮制5～6 h，過篩后再除去油脂得到骨膠溶液，再將骨膠溶液進(jìn)行冷凍干燥，所得骨蛋白粉利用雙縮脲法測(cè)量蛋白含量。

1.3.2 不同水解度PBPH的制備

參照刁靜靜等[7]的方法并稍作修改。將制備好的豬骨蛋白粉配制成底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的蛋白溶液，置于初始溫度為25 ℃的水浴中進(jìn)行加熱并將溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.0，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，加入堿性蛋白酶，使酶與底物質(zhì)量比為1∶100，再進(jìn)行振蕩水解，水解時(shí)間分別為0、1、2、3、4 h和5 h，反應(yīng)過程中不斷加入1 mol/L的NaOH溶液使pH值保持恒定，記錄耗堿量，用于水解度的計(jì)算。水解結(jié)束后將溶液pH值調(diào)至7.0，之后將溫度升高至95 ℃，保持10 min使酶滅活。所得溶液在4 ℃ 、5 000×g離心15 min，經(jīng)雙縮脲法測(cè)定蛋白含量后，取上清液進(jìn)行真空冷凍干燥得到凍干粉，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.3 水解度的測(cè)定

水解度的測(cè)定采用pH-stat法[11]，水解度的計(jì)算公式如下：

式中：DH為水解度/%；h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量/（mmol/L）；htot為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量/（mmol/L），骨蛋白htot為11.1 mmol/L；B為水解過程中的耗堿量/mL；Nb為堿液濃度/（mol/L）；MP為水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；1/α為校正系數(shù)（堿性蛋白酶為1.01）。

豬骨蛋白經(jīng)過0、1、2、3、4、5 h的水解所得到的水解度經(jīng)過計(jì)算分別為0%、5.6%、7.8%、11.1%、14.3%、17.2%。

1.3.4 不同水解度PBPH乳化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 EAI及ESI的測(cè)定

參照Pearce等[11]的方法并稍做修改，取8 mL 1 mg/mL PBPH溶液加入2 mL一級(jí)大豆色拉油于直徑2.5 cm的離心管中，內(nèi)切式勻漿機(jī)17 500 r/min勻漿2 min，勻漿后立即從離心管底部0.5 cm處取樣0.5 μL，用0.1% SDS溶液稀釋100 倍，振蕩混勻后以SDS溶液作為空白，讀取樣品在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度記作A0，樣品放置10 min后再次在相同位置取勻漿液50 μL，重復(fù)上述步驟記錄A10。樣品的EAI和ESI分別通過下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：C為樣品質(zhì)量濃度/（g/L）；Φ為油相比例；A0為樣品初始吸光度；N為稀釋倍數(shù)；A10為樣品放置10 min后的吸光度。

1.3.4.2 表面疏水性的測(cè)定

參照Xu Xingfeng等[9]的方法，使用1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（1-anilino-8-naphthalenesulfonate，ANS）作為疏水熒光探針。樣品溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至質(zhì)量濃度范圍為0.01～0.1 mg/mL。將20 μL 8 mmol/L的ANS溶液加入到2 mL的樣品溶液中，并在室溫及避光條件下反應(yīng)20 min。利用熒光光譜儀測(cè)量不同濃度樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm與470 nm。在通過線性回歸分析計(jì)算不同濃度對(duì)應(yīng)不同熒光強(qiáng)度的初始斜率。

1.3.4.3 Zeta電位和粒徑的測(cè)量

參照Yin Baoru等[12]的方法并稍作修改，取均質(zhì)后的乳狀液50 μL，利用0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液將其混勻稀釋100 倍，在注入到彎曲毛細(xì)管中，在常溫下使用Malvern激光粒度儀測(cè)定出含有不同水解度PBPH乳狀液的Zeta電位與粒徑。

1.3.4.4 光學(xué)顯微鏡觀察

使用光學(xué)顯微鏡對(duì)不同水解度的PBPH制備的乳狀液進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，取1.3.4.1節(jié)中均質(zhì)后的乳狀液7 μL于載玻片上，然后蓋上蓋玻片后，在XPS-8C型光學(xué)顯微鏡下，在SP 40/100的物鏡下，觀察樣品，進(jìn)行顯微照片的拍攝。

1.3.5 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用Sionkowska等[13]的方法并作適當(dāng)修改，將凍干所得的不同水解度的樣品分散于含0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）中，配制成最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液。10 000×g離心10 min，取上清液過濾膜，孔徑為0.45 μm，利用Water 2690型液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定，流動(dòng)相為磷酸鈉緩沖液。色譜柱為Shodex protein KW-804型（300 mm×8 mm，7 μm），檢測(cè)器為Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1 mL/min，柱溫25 ℃。標(biāo)準(zhǔn)蛋白用Marker（分子質(zhì)量為6.5～200 kDa）進(jìn)行校正，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 ±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）或差異極顯著性（P＜0.01）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解度PBPH的乳化性質(zhì)

2.1.1 EAI及ESI

從表1可知，豬骨蛋白經(jīng)過水解處理后EAI與ESI顯著提高，并且隨著水解度的增高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（P＜0.05），在水解度為11.1%時(shí)表現(xiàn)出較好的EAI和最高的ESI。乳狀液體系是一種多相體系，并且液滴有自發(fā)結(jié)合以降低體系總界面自由能的傾向，Hou Zhanqun等[14]研究表明界面張力越低，乳狀液越穩(wěn)定。因此，為了減少這種不穩(wěn)定程度，就需要降低油水界面的張力，使乳化劑快速吸附到油水界面上，增加乳狀液的穩(wěn)定性。由于經(jīng)過水解后多肽鏈數(shù)量增加，PBPH分子柔性增加并且構(gòu)象迅速發(fā)生變化，使得親水基延伸至水相，疏水基延伸至油相從而快速的吸附到油-水界面上以此來降低界面張力，因此經(jīng)過水解處理會(huì)提高PBPH的EAI和ESI[15]。但是水解度7.8%的樣品EAI高于11.1%的樣品，其ESI卻低于11.1%的樣品，可能是由于11.1%的PBPH的表面疏水性較大，所以在乳狀液均質(zhì)過程中的高速旋轉(zhuǎn)可能會(huì)導(dǎo)致由疏水相互作用所引起的部分蛋白質(zhì)絮凝，使得粒徑稍大于7.8%的樣品，從而影響到EAI的測(cè)定結(jié)果，但經(jīng)過放置后，11.1%的樣品較之其他水解度的樣品是趨于穩(wěn)定的，而水解度為7.8%的樣品會(huì)由于靜電排斥力（表面電荷），空間位阻效應(yīng)（界面膜厚度、表面疏水性、吸附能力）等機(jī)制的影響而發(fā)生部分液滴的聚集，使得ESI低于水解度為11.1%的PBPH。而對(duì)于水解度為14.3%和17.2%樣品而言，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，水解度增大，維持蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)力（氫鍵、范德華力、離子鍵等）遭到破壞，使得液滴表面的界面膜變薄，增大了其界面張力，進(jìn)而導(dǎo)致PBPH的EAI與ESI的降低[16]。Xu Xingfeng等[9]的研究表明，水解時(shí)間較短的蛋白質(zhì)水解物在均質(zhì)期間可以快速吸附到油滴表面上并能有效防止液滴間的聚集，表現(xiàn)出很高的乳化能力，這與本實(shí)驗(yàn)水解時(shí)間3 h，相應(yīng)水解度為11.1%的PBPH樣品的ESI最好的研究結(jié)果一致。Cheng Yu等[17]對(duì)馬鈴薯蛋白水解物的乳化性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，過度水解所得到的小肽或者肽段可能不是兩性分子，不能很好地吸附于油水界面，因此乳化性較差，這進(jìn)一步證明了水解度為17.4%的樣品乳化性降低的原因。

表1 水解度對(duì)PBPH的EAI和ESI的影響Table 1 Effects of different degrees of hydrolysis on EAI and ESI of porcine bone protein hydrolysates

2.1.2 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其功能性質(zhì)有著非常重要的作用，對(duì)于高分子化合物為乳化劑的乳狀液體系來說通過空間穩(wěn)定作用液滴表面的高分子吸附層可以阻止液滴間的相互碰撞和聚合，增加乳狀液的穩(wěn)定性[18]。在乳化體系中，空間穩(wěn)定作用的強(qiáng)度通常隨著界面層的厚度以及疏水性的增加而增加[5]，這也就意味著表面疏水性越高，其空間穩(wěn)定作用力越強(qiáng)。因此為觀察不同水解度的PBPH在油滴上的吸附效果，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定表面疏水性的變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖1。

圖1 不同水解度對(duì)PBPH表面疏水性的影響Fig. 1 Effects of different degrees of hydrolysis on surface hydrophobicity of porcine bone protein hydrolysates

由圖1可以觀察到，不同水解度的PBPH的表面疏水性隨著水解度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)（P＜0.05），未經(jīng)水解的豬骨蛋白的表面疏水性僅為182.25，而經(jīng)過水解后，水解度為5.6%、7.8%、11.1%、14.3%、17.2%的PBPH的表面疏水性分別增加至223.18、413.39、488.15、321.49、218.28。其中水解度為11.1%的樣品顯示出最高的表面疏水性，與未經(jīng)水解的豬骨蛋白相比其表面疏水性增長(zhǎng)到近3 倍。在適度水解條件下，PBPH的表面疏水性與未水解的樣品相比顯著增加，這可能是由于適度水解后，蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生分解，β-折疊結(jié)構(gòu)展開，使包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)暴露出來，因此增加了蛋白水解物的表面疏水性[19]。但當(dāng)水解達(dá)到一定程度時(shí)表面疏水性會(huì)降低，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能有兩點(diǎn)：一是由于水解時(shí)間過長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域被破壞導(dǎo)致表面疏水性的降低；二是由于水解度的增加提高了PBPH的表面疏水性，表面疏水性的增加會(huì)使PBPH間的疏水相互作用增強(qiáng)，當(dāng)疏水相互作用達(dá)到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)之間會(huì)發(fā)生聚集形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，復(fù)合物的形成會(huì)掩蓋之前暴露出來的疏水性位點(diǎn)，從而降低了PBPH的表面疏水性[19]。可以發(fā)現(xiàn)不同水解度的表面疏水性的變化趨勢(shì)與ESI的測(cè)定結(jié)果基本一致，因此可以認(rèn)為PBPH的表面疏水性的大小與ESI之間存在正相關(guān)的關(guān)系，這是由于蛋白質(zhì)表面疏水性的增加，增大了其在油滴上的吸附能力，使疏水基團(tuán)快速延伸至油相，蛋白質(zhì)更加快速、致密地吸附到油滴上從而形成帶電界面層，提高了界面處的蛋白質(zhì)濃度，從而達(dá)到了降低表面張力、穩(wěn)定乳狀液的目的[1]。但由于11.1%的PBPH具有相對(duì)較高的表面疏水性，因此在乳狀液均質(zhì)期間可能會(huì)發(fā)生由疏水相互作用所導(dǎo)致的部分蛋白質(zhì)的聚集，進(jìn)而造成EAI的降低。

2.1.3 Zeta電位分析

在乳狀液體系中，相對(duì)于空間穩(wěn)定作用，靜電相互作用也同樣是一種維持乳狀液穩(wěn)定的一種重要的作用力[20]，靜電相互作用的存在可以有效防止由范德華力及疏水相互作用所導(dǎo)致的液滴間的聚集，以此來穩(wěn)定乳狀液。Zeta電位絕對(duì)值的大小是衡量靜電相互作用程度的重要指標(biāo)，因此Zeta電位與乳狀液的物理穩(wěn)定性具有正相關(guān)性，可以作為評(píng)定乳狀液物理穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。Zeta電位的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，無論是未水解的豬骨蛋白還是經(jīng)過水解的豬骨蛋白，所制備的乳狀液都顯示為高度負(fù)電，這是由于此時(shí)pH值處于中性，H＋濃度較高，羧基（—COOH）和氨基（—NH3＋）沒有發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致負(fù)電荷的產(chǎn)生[21]。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度增大，Zeta電位的絕對(duì)值呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)（P＜0.05），水解度為11.1%的樣品組顯示帶有最高的凈負(fù)電荷。這就進(jìn)一步解釋了在此水解度條件下具有較高ESI的原因。水解后的PBPH樣品顯示出相對(duì)較高的靜電荷是由于豬骨蛋白經(jīng)過水解后，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得更多的極性基團(tuán)暴露出來，增加了其表面電位[22]。隨著水解度的增加，Zeta電位的降低可能與表面疏水性過高所引起的蛋白質(zhì)間的聚集有關(guān)，隨著水解的進(jìn)行，PBPH相互聚集形成復(fù)合物，復(fù)合物吸附在界面處，包埋了界面蛋白所暴露出的極性基團(tuán)從而導(dǎo)致表面電位的降低。

圖2 不同水解度對(duì)PBPH乳狀液Zeta電位的影響Fig. 2 Effects of different degrees of hydrolysis on zeta potential of porcine bone protein hydrolysates in emulsion

2.1.4 粒徑與乳狀液光學(xué)顯微鏡結(jié)果

為進(jìn)一步分析不同水解度PBPH的乳化能力，測(cè)定不同水解度PBPH制備的乳狀液的光學(xué)顯微結(jié)果見圖3，比表面積平均粒徑見圖4。隨著水解度的增加，粒徑的變化呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)（P＜0.05），水解度為11.1%的PBPH顯示出最小的平均粒徑，這表明在適度水解條件下PBPH能夠在乳化過程中更快速地吸附到液滴表面形成帶電界面層，降低界面張力從而有效防止液滴的聚集，所形成的乳狀液穩(wěn)定性較好。Li Yuanyuan等[23]對(duì)利用玉米蛋白水解物所制備的乳狀液進(jìn)行了激光共聚焦的觀察，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)可以吸附到油水界面上并在油滴周圍形成一層帶電蛋白質(zhì)薄膜，從而增加界面膜的厚度。此外，Wooster等[24]研究表明在乳清蛋白質(zhì)作為乳化劑的水包油乳狀液中，蛋白質(zhì)形成較厚的界面膜的同時(shí)可以和碳水化合物通過空間位阻效應(yīng)有效降低乳狀液的絮凝和聚集。多肽所形成的界面膜是不需要通過非共價(jià)相互作用的聚集體[25]。He Dong等[26]研究表明靜電相互作用是這一過程中的重要作用力，強(qiáng)烈的靜電相互作用力與疏水鍵以及氫鍵一起作用會(huì)促使多肽鏈聚集在乳狀液液滴表面最終形成界面膜，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未經(jīng)過水解的豬骨蛋白的表面疏水性和表面電位較低，所以其吸附到液滴表面的能力較差，所形成的乳化液滴界面膜薄而不均，EAI與ESI較差。而經(jīng)過適當(dāng)水解的豬骨蛋白吸附性較好，形成的界面膜致密而均勻，可以很好地防止液滴間的聚集及降低界面張力，所制備的乳狀液的平均粒徑較小，因此EAI與ESI較高[1]。這也進(jìn)一步說明了表面電位、表面疏水性與平均粒徑之間的相互關(guān)系。而隨著水解度的提高，平均粒徑變大原因同樣與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成及油滴間的聚集有關(guān)，這與之前表面疏水性的研究結(jié)果形成了對(duì)應(yīng)。

為更直觀地觀察用不同水解度的PBPH所制備乳狀液的乳化效果，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)放置10 min后的不同水解度PBPH所制備的乳狀液進(jìn)行液滴大小及分布情況的微觀觀察（圖3）。未經(jīng)過水解的豬骨蛋白所制備的乳狀液的液滴粒徑較大，且分散不均勻，部分還具有聚集的趨勢(shì)，而由于水解后提高了豬骨蛋白的乳化能力，因此所形成的乳狀液的液滴粒徑明顯變小，具體的液滴大小及分散情況與水解度有關(guān)，總體趨勢(shì)與粒徑的測(cè)定結(jié)果相符。利用PBPH制備的乳狀液其液滴大小隨著水解度增加呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)（P＜0.05），在適度水解條件（11.1%）下液滴粒徑相對(duì)較小且分散均勻，而水解度過高時(shí)（14.3%和17.2%）液滴分散不均勻，粒徑變大并有聚集的趨勢(shì)，此時(shí)乳液的穩(wěn)定性較差。這與之前平均粒徑以及ESI的測(cè)量結(jié)果相吻合。

圖3 不同水解度PBPH制備的乳狀液的光學(xué)顯微照片F(xiàn)ig. 3 Optical photomicrographs of emulsions prepared with porcine bone protein hydrolysates with different DHs

圖4 不同水解度PBPH制備的乳狀液比表面積平均粒徑Fig. 4 Specific surface area average particle size of emulsions prepared with porcine bone protein hydrolysates with different DHs

2.2 PBPH的相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖5 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量分布圖Fig. 5 Standard curve of molecular mass and molecular mass distribution of protein marker

圖6 不同水解度對(duì)PBPH分子質(zhì)量分布的影響Fig. 6 Effect of different degrees of hydrolysis on molecular mass distribution of porcine bone protein hydrolysates

表2 不同吸收峰的保留時(shí)間與分子質(zhì)量分布Table 2 Retention times and molecular mass distribution of different absorption peaks

為觀察不同水解度的PBPH分子質(zhì)量分布情況的變化，采用分子排阻色譜對(duì)其分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量分布圖見圖5，不同水解度的PBPH的凝膠色譜圖見圖6。未經(jīng)水解的豬骨蛋白的分子排布圖顯示出了5 個(gè)主要吸收峰，具體見表2。通過圖6可以觀察到，與未水解的豬骨蛋白圖譜相比，隨著水解度的增加，峰1逐漸減少直至消失，而在保留時(shí)間23～27 min之間相繼出現(xiàn)較強(qiáng)的譜峰吸收并不斷積累，說明大分子肽在反應(yīng)過程中易于解聚，并且分離的單體被堿性蛋白酶專一切割成較為集中的片段組成（23～27 min），并不斷有小分子肽段（＞31 min）生成[27]。

圖7 不同水解度對(duì)水解豬骨蛋白分子質(zhì)量分布的影響Fig. 7 Percentage peak areas obtained with high-performance size exclusion chromatograph for porcine bone protein hydrolysates with different DHs

由圖7可見，從反應(yīng)進(jìn)程看，隨著水解度的增加，大分子肽（＞89、48～89 kDa）的所占比例迅速減少，小分子比例不斷增加，當(dāng)水解度達(dá)到11.1%時(shí)，分子質(zhì)量高于89 kDa的肽段消失，而水解度進(jìn)一步增加時(shí)又有小部分大分子肽生成，說明此時(shí)發(fā)生了蛋白質(zhì)的聚集。而13～48 kDa的肽段起初隨著水解度的增加而增加，當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)降低，說明水解過程中既有多肽鏈的斷裂，同時(shí)也伴有蛋白質(zhì)的聚集，二者是交互進(jìn)行的[28]。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即水解度為7.8%與11.1%時(shí)的乳化性較好，此時(shí)13～48 kDa肽段所占比例較高，水解度為11.1%時(shí)乳化性達(dá)到了最大（68.47%），說明此范圍的肽段對(duì)乳化性的提高有著重要的作用[29]。分子質(zhì)量在5～13 kDa范圍的肽段總體呈現(xiàn)上下浮動(dòng)的變化且漲落較小，也就是說其降解速率接近生成速率，說明這段范圍內(nèi)的分子間存在高度偶聯(lián)且相互制約的關(guān)系[30]。分子質(zhì)量低于5 kDa的小肽含量隨著水解度的增大而顯著增加，這是由于豬骨蛋白的空間結(jié)構(gòu)較為松散，易于降解以及堿性蛋白酶的高度專一性的切割特點(diǎn)所致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以不用水解時(shí)間為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)不同水解度PBPH在乳化體系中的作用機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果表明PBPH的乳化特性受水解度的影響，對(duì)比未經(jīng)水解的豬骨蛋白，PBPH的EAI、ESI、表面疏水性、Zeta電位，均得到顯著提高，并隨著水解時(shí)間和水解度的增大，呈先增加后降低的趨勢(shì)，水解度為11.1%的PBPH表現(xiàn)出最好的乳化能力，并具有最小粒徑及最均勻的液滴分布?？傊?，水解處理可以顯著提高豬骨蛋白在乳化體系中的乳化能力，并且水解時(shí)間為3 h，水解度11.1%的PBPH作為天然乳化劑可以有效提高食品乳狀液體系的物理穩(wěn)定性。