3 種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)的影響

吳 偉，吳曉娟*，楊滔滔

米糠是糙米加工成精米過(guò)程中碾下的種皮層、外胚乳層、糊粉層、胚芽和少量碎米的混合物。我國(guó)是稻谷生產(chǎn)大國(guó)，米糠年產(chǎn)量近1 400萬(wàn) t[1]。米糠營(yíng)養(yǎng)豐富，含有14%～24%脂肪、12%～16%蛋白質(zhì)、23%～30%膳食纖維和多種生理活性物質(zhì)，極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2]。在食品工業(yè)中，米糠主要用于提取米糠油和米糠蛋白[3]。米糠蛋白氨基酸種類齊全，組成平衡，接近氨基酸理想構(gòu)成模式，還具有消化性能好、抗過(guò)敏性的特點(diǎn)，可作為嬰幼兒食品的蛋白原料，是一種高附加值的植物蛋白資源[4]。

近年來(lái)，由于我國(guó)農(nóng)業(yè)環(huán)境中鎘污染現(xiàn)象突出，稻谷制品鎘含量超標(biāo)情況比較嚴(yán)重。在稻谷籽粒中，鎘主要分布在蛋白含量高的米糠層，米糠平均鎘含量約為稻谷的2 倍，由此可見(jiàn)，米糠蛋白在開(kāi)發(fā)利用之前需進(jìn)行除鎘處理[5]。一些天然的有機(jī)酸，如：酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等，能與金屬離子形成可溶性絡(luò)合物，常作為除鎘劑使用[6]。楊滔滔等[7]將傳統(tǒng)“堿溶酸沉”提取米糠蛋白生產(chǎn)工藝的鹽酸替換為有機(jī)酸，在不同pH值條件下酸沉制備米糠蛋白，發(fā)現(xiàn)酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸具有很好的除鎘效果，但會(huì)引起米糠蛋白功能性質(zhì)的改變。蛋白質(zhì)的功能特性與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[8]，功能性質(zhì)的改變必然是由結(jié)構(gòu)特征的變化引起的[9-10]。目前鮮見(jiàn)關(guān)于有機(jī)酸酸沉對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征影響的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸分別在不同pH值條件下酸沉制備米糠蛋白，以鹽酸為對(duì)照，研究有機(jī)酸酸沉對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)特征的影響，以期為開(kāi)發(fā)有機(jī)酸除鎘技術(shù)和提高米糠蛋白附加值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠 湖南金霞九鼎農(nóng)牧有限公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB）、1-苯氨基萘-8-磺酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鹽酸、酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、三羥甲基氨基甲烷、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；IRTracer-100傅里葉紅外光譜儀、LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司；Nano ZS納米粒度分析儀 英國(guó)Malvern公司；Healthcare SE260電泳儀 美國(guó)GE公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白的制備

參考楊滔滔等[7]酸沉處理的方法制備米糠蛋白，脫脂米糠粉碎過(guò)60 目篩備用，取100 g脫脂米糠與900 mL去離子水混合，40 ℃條件下磁力攪拌4 h，并用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9.0，之后在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，取上清液酸沉，所用酸分別為鹽酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸，pH值分別為2.0、3.0、3.5、4.0，常溫靜置2 h后于4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，取沉淀水洗3 次，分散于去離子水中并調(diào)pH值至7.0，隨后透析72 h去除堿溶酸沉過(guò)程中形成的鹽類物質(zhì)，-20 ℃冷凍24 h以上，冷凍干燥得到米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白游離巰基、總巰基含量的測(cè)定

參考Huang Youru等[11]方法。稱取120 mg米糠蛋白，分散于20 mL 0.1 mol/L含有l(wèi) mmol/L乙二胺四乙酸和1%十二烷基硫酸鈉pH 8.0的磷酸鹽緩沖液，常溫條件下磁力攪拌2 h后10 000 r/min離心10 min，采取考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，采取DNTB比色法在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以13 600 mol/（L·cm）消光系數(shù)計(jì)算米糠蛋白游離巰基和總巰基含量。

1.3.3 米糠蛋白傅里葉紅外光譜的測(cè)定

取2 mg米糠蛋白樣品和200 mg干燥的溴化鉀混合，研磨混勻后制成透明薄片，室溫干燥環(huán)境中進(jìn)行傅里葉紅外掃描。掃描條件：掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，樣品掃描128 次。

1.3.4 米糠蛋白粒徑的測(cè)定

將米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，磁力攪拌2 h后室溫10 000 r/min離心20 min收集上清液并稀釋，取上清液1 mL，采用Nano ZS納米粒度分析儀測(cè)定米糠蛋白粒徑分布。

1.3.5 米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

參考Liu Yan等[12]方法。將米糠蛋白溶解于pH 7.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下磁力攪拌2 h后10 000 r/min離心20 min，收集上清液。以考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，通過(guò)稀釋使蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL。采用F-4600型熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm條件下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜，以pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液為空白。

1.3.6 米糠蛋白表面疏水性的測(cè)定

采用熒光探針?lè)╗13]測(cè)定表面疏水性。以1-苯氨基萘-8-磺酸為外源熒光探針，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的米糠蛋白在370 nm激發(fā)波長(zhǎng)和490 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.7 凝膠色譜測(cè)定米糠蛋白的分子質(zhì)量分布

參考Fang Yanqing等[14]方法。將米糠蛋白分散于0.05 mol/L含有0.05 mol/L氯化鈉pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白溶液，室溫條件下磁力攪拌2 h后10 000 r/min離心30 min，取上清液用孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜過(guò)濾，收集濾液，采用LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件：TSKgel SW G4000 SWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm，8 μm）；檢測(cè)器為Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相為0.05 mol/L含0.05 mol/L氯化鈉pH 7.2的磷酸鹽緩沖液；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Wu Wei等[15]的不連續(xù)電泳方法。分離膠用量12.5%，濃縮膠用量4%，pH 8.3的電極緩沖液含0.1%十二烷基硫酸鈉、0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷、0.384 mol/L甘氨酸，用樣品溶解液（內(nèi)含5% β-巰基乙醇、2%十二烷基硫酸鈉、0.02%溴酚藍(lán)、10%甘油、0.01 mol/L pH 8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）配制蛋白質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的樣品。電泳采用0.75 mm的凝膠板；上樣量為12 μL；樣品在濃縮膠時(shí)電流為10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后電流升至25 mA，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次。數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003和Origin 7.5進(jìn)行處理，結(jié)果以 ±s表示。差異分析采用最小顯著差異法，取95%置信度（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸沉處理對(duì)米糠蛋白巰基含量的影響

表1 不同有機(jī)酸酸沉對(duì)米糠蛋白總巰基、游離巰基含量的影響Table 1 Effect of acid precipitation with different organic acids on the contents of total sulphydryl and free sulphydryl of rice bran protein nmol/mg

如表1所示，采用同種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值下降，米糠蛋白的游離巰基含量逐漸上升，總巰基含量無(wú)顯著變化。游離巰基的增加一方面可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)導(dǎo)致內(nèi)部巰基暴露，另一方面可能是二硫鍵斷裂生成新巰基，但新巰基生成必然導(dǎo)致總巰基含量增加[16-17]，表1中米糠蛋白總巰基含量無(wú)顯著變化，從側(cè)面說(shuō)明酸沉pH值下降沒(méi)有造成米糠蛋白二硫鍵的斷裂，而是米糠蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，導(dǎo)致巰基暴露程度不斷增加。Liu Qian等[18]在研究pH值偏移處理對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸處理（pH 1.5，3 h）后大豆分離蛋白的總巰基含量無(wú)顯著變化，而游離巰基含量增加，并提出二硫鍵在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，不易斷裂。相比于鹽酸，采用有機(jī)酸在相同pH值條件下酸沉制備的米糠蛋白游離巰基含量顯著減小，這可能是因?yàn)? 種有機(jī)酸的酸性較弱，對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)的影響較小。

2.2 酸沉處理對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 不同有機(jī)酸酸沉制備米糠蛋白的傅里葉變換紅外光譜酰胺I帶Fig. 1 Amide I band of Fourier transform infrared spectra of rice bran protein precipitated with different organic acids

參考王長(zhǎng)遠(yuǎn)等[19]方法對(duì)米糠蛋白去卷積酰胺I帶圖譜進(jìn)行鑒定，如圖1所示。β-折疊結(jié)構(gòu)：1 617～1 618、1 626～1 627、1 637～1 638、1 695～1 696 cm-1；α-螺旋結(jié)構(gòu)：1 646、1 651～1 653 cm-1；無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)：1 660～1 661 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)：1 670～1 672、1 681～1 683 cm-1。運(yùn)用Peak Fit 4.12軟件對(duì)酰胺I帶圖譜進(jìn)行分峰擬合，得到米糠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，如圖2所示。采用同種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值的下降，米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量下降，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量上升，α-螺旋相對(duì)含量則無(wú)顯著變化。出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是因?yàn)?，在酸性環(huán)境中米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角會(huì)向α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，且隨著pH值下降，轉(zhuǎn)化程度增加，而將pH值再調(diào)回7.0時(shí)米糠蛋白發(fā)生聚集，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化，但是蛋白結(jié)構(gòu)在展開(kāi)又聚集的過(guò)程中，米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)難以完全按照之前的方式重組，整體趨于向無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變，且隨著酸沉pH值下降，米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度越大，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量越高。趙謀明等[20]采用圓二光譜儀分析酸性條件對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸處理導(dǎo)致蛋白解離程度增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲含量上升。采用不同有機(jī)酸和鹽酸在相同pH值條件下酸沉?xí)r，米糠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成無(wú)顯著差異。

圖2 不同有機(jī)酸酸沉對(duì)米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的影響Fig. 2 Effect of acid precipitation with different organic acids on secondary structure contents of rice bran protein

2.3 酸沉處理對(duì)米糠蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖3 不同有機(jī)酸酸沉制備米糠蛋白的熒光光譜Fig. 3 Intrinsic emission fluorescence spectra of rice bran protein precipitated with different organic acids

如圖3所示，采用同種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值下降，米糠蛋白的熒光強(qiáng)度先增加后下降，當(dāng)酸沉pH值為3.0時(shí)，米糠蛋白的熒光強(qiáng)度最高；相應(yīng)的，米糠蛋白的最大熒光峰位移也先向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)（紅移），然后再向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)（藍(lán)移）。Jiang Jiang等[21]在研究pH值偏移處理對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸處理后大豆蛋白表面的色氨酸殘基暴露程度增加，導(dǎo)致蛋白熒光強(qiáng)度增加，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移。此外，Dong Xinhong等[22]在研究酸性條件下花生分離蛋白亞基結(jié)構(gòu)的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在極端酸性條件下（pH值小于3.0），蛋白分子間的靜電斥力因離子靜電屏蔽而減弱，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集而使結(jié)構(gòu)變得緊密，暴露于親水環(huán)境中色氨酸殘基減少。因此，米糠蛋白的酸沉pH值由4.0下降至3.0時(shí)，米糠蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，內(nèi)部色氨酸殘基暴露程度不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度不斷增加，最大熒光峰位發(fā)生紅移；而當(dāng)酸沉pH值為2.0時(shí)，蛋白質(zhì)之間的靜電斥力減少而發(fā)生聚集，導(dǎo)致米糠蛋白熒光強(qiáng)度降低，最大熒光峰位反而發(fā)生藍(lán)移。相比鹽酸酸沉，采用3 種有機(jī)酸在相同pH值條件下酸沉?xí)r，米糠蛋白的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，原因可能是相比鹽酸酸沉，相同pH值條件下3 種有機(jī)酸酸沉使得米糠蛋白表面的色氨酸殘基暴露程度增加。

2.4 酸沉處理對(duì)米糠蛋白表面疏水性的影響

如圖4所示，采用同種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值的下降，米糠蛋白的表面疏水性先增加后下降，當(dāng)酸沉pH值為3.0時(shí)，米糠蛋白的表面疏水性達(dá)到最高。這可能是因?yàn)楫?dāng)酸沉pH值由4.0下降至3.0時(shí)，米糠蛋白的結(jié)構(gòu)展開(kāi)程度不斷增加，更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來(lái)[23-24]，導(dǎo)致米糠蛋白表面疏水性增加；而酸沉pH值繼續(xù)下降至2.0時(shí)，蛋白質(zhì)之間的靜電斥力減少，部分米糠蛋白發(fā)生了聚集反應(yīng)[25]，降低了米糠蛋白疏水基團(tuán)整體的暴露程度。3 種有機(jī)酸在pH 2.0條件下酸沉?xí)r，制備米糠蛋白的表面疏水性顯著小于相同條件下鹽酸酸沉制備的米糠蛋白表面疏水性（P＜0.05），3 種有機(jī)酸和鹽酸在pH 3.0、3.5和4.0條件下酸沉?xí)r，米糠蛋白的表面疏水性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 酸沉處理對(duì)米糠蛋白分子質(zhì)量分布的影響

表2 米糠蛋白的分子質(zhì)量分布圖中峰面積百分比Table 2 Peak area percentage in molecular mass distribution of rice bran protein%

如表2所示，采用3 種有機(jī)酸和鹽酸在不同pH值條件下酸沉，當(dāng)酸沉pH值為4.0、3.5、3.0時(shí)，米糠蛋白分子質(zhì)量分布圖中出現(xiàn)3 個(gè)峰，保留時(shí)間依次為5.58、10.62、11.65 min，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量依次減小。采用同種酸酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值的下降，保留時(shí)間5.58 min處的峰面積百分比沒(méi)有明顯變化，保留時(shí)間10.62 min處的峰面積百分比逐漸增加，保留時(shí)間11.65 min處的峰面積百分比逐漸減少，表明酸沉沒(méi)有導(dǎo)致米糠蛋白形成高分子質(zhì)量聚集體，但是小分子質(zhì)量蛋白逐漸形成大分子質(zhì)量蛋白。當(dāng)酸沉pH值為2.0時(shí)，3 種有機(jī)酸和鹽酸酸沉制備米糠蛋白分子質(zhì)量分布圖中都只出現(xiàn)2 個(gè)峰，保留時(shí)間依次為5.58、10.62 min，而保留時(shí)間11.65 min處的峰消失，表明較低pH值條件下的酸沉可導(dǎo)致米糠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分解離和聚集。在相同酸沉pH值條件下，3 種有機(jī)酸和鹽酸酸沉制備米糠蛋白分子質(zhì)量分布圖非常接近，表明3 種有機(jī)酸酸沉基本不影響米糠蛋白的分子質(zhì)量分布。Lakemond等[26]研究pH值對(duì)大豆分離蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸處理（pH 2.0）導(dǎo)致大豆蛋白部分酸性亞基和堿性亞基解離，而解離出來(lái)的亞基在pH調(diào)回7.0的過(guò)程中發(fā)生了重組裝，導(dǎo)致蛋白分子質(zhì)量分布發(fā)生了變化。因此，可推測(cè)當(dāng)酸沉pH值為2.0時(shí)，米糠蛋白發(fā)生了亞基解離，小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在調(diào)回中性時(shí)形成大分子質(zhì)量的蛋白分子，導(dǎo)致保留時(shí)間11.65 min處的峰消失[27]。

2.6 酸沉處理對(duì)米糠蛋白粒徑的影響

圖5 不同有機(jī)酸酸沉對(duì)米糠蛋白粒徑分布的影響Fig. 5 Effect of acid precipitation with different organic acids on particle size distribution of rice bran protein

如圖5所示，采用同種酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值的下降，米糠蛋白的平均水平粒徑不斷增大。這可能是因?yàn)殡S著酸沉pH值的下降，米糠蛋白結(jié)構(gòu)松散程度增加，肽鏈不斷展開(kāi)，在重新調(diào)回中性（pH 7.0）的時(shí)候，蛋白雖然會(huì)發(fā)生聚集，但難以恢復(fù)到天然的緊密球狀結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致粒徑相對(duì)增大[28]。采用不同酸酸沉，當(dāng)pH值為2.0時(shí)，由4 種酸酸沉制備米糠蛋白的粒徑分布之間沒(méi)有差異；當(dāng)酸沉pH值為3.0、3.5時(shí)，由蘋(píng)果酸、檸檬酸酸沉制備的米糠蛋白粒徑小于鹽酸、酒石酸酸沉米糠蛋白。此外，米糠蛋白的粒徑分布均只有一個(gè)峰，表明有機(jī)酸酸沉制備的米糠蛋白沒(méi)有解離出新的亞基或形成聚集體。

2.7 酸沉處理對(duì)米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響

圖6 不同有機(jī)酸酸沉對(duì)米糠蛋白亞基結(jié)構(gòu)的影響Fig. 6 Effect of acid precipitation with different organic acids on subunit structure of rice bran protein

如圖6所示，采用同種酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值的下降，米糠蛋白電泳條帶顏色深淺無(wú)顯著變化，也沒(méi)有出現(xiàn)條帶增加或消失的現(xiàn)象，說(shuō)明米糠蛋白的亞基結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化。在酸性環(huán)境中，蛋白分子間靜電排斥力較強(qiáng)，蛋白會(huì)發(fā)生亞基解離，但是解離的亞基在pH值調(diào)回中性時(shí)發(fā)生聚集，不再以解離狀態(tài)單獨(dú)存在[29-30]。所以，米糠蛋白的酸沉pH值下降，只是促使米糠蛋白的亞基解離，并沒(méi)有對(duì)亞基進(jìn)一步破壞，形成新的亞基。采用不同酸在相同pH值條件下酸沉?xí)r，米糠蛋白的亞基結(jié)構(gòu)變化無(wú)顯著差異。

3 結(jié) 論

采用酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸分別在pH 4.0、3.5、3.0、2.0條件下酸沉制備米糠蛋白，通過(guò)測(cè)定可表征蛋白結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，探索有機(jī)酸酸沉處理對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)特征的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用同種有機(jī)酸在不同pH值條件下酸沉?xí)r，隨著酸沉pH值下降，米糠蛋白游離巰基含量上升，總巰基含量無(wú)顯著變化；無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量上升，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量下降，α-螺旋相對(duì)含量無(wú)顯著變化；內(nèi)源熒光強(qiáng)度和表面疏水性均先增加后下降，在pH 3.0時(shí)達(dá)到最大值。這表明有機(jī)酸酸沉處理沒(méi)有造成米糠蛋白二硫鍵的斷裂，但使蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，當(dāng)pH值再調(diào)回7.0時(shí)發(fā)生聚集，米糠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在這一過(guò)程中發(fā)生了變化。相比于傳統(tǒng)的鹽酸酸沉，在相同pH值條件下采用有機(jī)酸酸沉制備的米糠蛋白，其總巰基含量無(wú)顯著差別，游離巰基含量較低；二級(jí)結(jié)構(gòu)和表面疏水性無(wú)顯著差異，內(nèi)源熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。分子質(zhì)量分布、粒徑分布及電泳分析結(jié)果表明，有機(jī)酸酸沉處理過(guò)程中，米糠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了部分解離和聚集，但沒(méi)有形成新的亞基和高分子質(zhì)量聚集體。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸在不同pH值條件下酸沉對(duì)米糠蛋白結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用除鎘米糠蛋白提供了的理論參考。