rCBFmax值對膠質(zhì)瘤術(shù)前分級(jí)的價(jià)值及與MVD表達(dá)間關(guān)系的初步研究

吳靜，汪文勝，顏劉清，陳楷哲，林翰波，成麗娜，賀鵬，梁倩雯

作者單位：廣東三九腦科醫(yī)院影像中心，廣州510510

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2016最新版中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的病理分類[1]，腦膠質(zhì)瘤(brain glioma，BG)分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ、Ⅱ級(jí))、高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ、Ⅳ級(jí))。臨床上，高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的治療方式及預(yù)后不同，前者術(shù)后常規(guī)輔以放化療，而后者大部分只需手術(shù)切除即可[2]。因此，術(shù)前對膠質(zhì)瘤級(jí)別的判斷對臨床治療有重要指導(dǎo)意義。微血管密度(microvessel density，MVD)與腫瘤侵襲性及預(yù)后密切相關(guān)，有研究認(rèn)為MVD與膠質(zhì)瘤級(jí)別相關(guān)[3-4]，目前主要依賴術(shù)后病理檢測。動(dòng)脈自旋標(biāo)記(arterial spin labeling，ASL)技術(shù)可半定量測定腫瘤內(nèi)部血流灌注情況，從而間接預(yù)測腫瘤微血管生成情況[5-6]。本研究擬通過測定平均最大相對腦血流量(mean maximum relative cerebral blood flow，rCBFmax)值與腫瘤MVD之間的相關(guān)性，并與病理結(jié)果對照，來評(píng)價(jià)ASL術(shù)前對膠質(zhì)瘤分級(jí)及無創(chuàng)性預(yù)測患者預(yù)后的能力。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2015年1月至2016年12月50例膠質(zhì)瘤患者的資料，術(shù)前均行ASL檢查，男性29例，女性21例，年齡6～72歲，平均37.2歲。根據(jù)2016年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的病理分類[1]，包括低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ、Ⅱ級(jí))30例、高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ、Ⅳ級(jí))20例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療等抗腫瘤治療，并在MR檢查后1 w內(nèi)手術(shù)。手術(shù)切除腫瘤組織均行MVD免疫組化表達(dá)測定。

1.2 ASL檢查

1.2.1 儀器設(shè)備

所有患者磁共振檢查均符合安全原則，并簽有知情同意書。采用GE Signa HDxt 3.0 T MRI掃描，8通道相控陣頭線圈。

1.2.2 主要成像序列與參數(shù)

3D-T1WI BRAVO序列：TR=8.8 ms，TE=3.5 ms，F(xiàn)A=15 度，層厚=1.2 mm，激勵(lì)次數(shù)=1，F(xiàn)OV=240 mm×240 mm，矩陣=256×256。3D-ASL 序列：TR=4599 ms，TE=9.8 ms，層厚=4 mm，激勵(lì)次數(shù)=3，F(xiàn)OV=240 mm×240 mm，矩陣=512×512，標(biāo)記后延遲時(shí)間=1525 ms。

1.2.3 3D-ASL圖像后處理

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GE工作站(ADW4.6)，采用Functool 軟件對圖像進(jìn)行后處理。

1.2.4 感興趣區(qū)選擇

由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)影像醫(yī)師共同討論，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，避開囊變、出血、壞死及鈣化區(qū)，選用熱點(diǎn)法放置感興趣區(qū)于腫瘤實(shí)性部分并測量3次取平均值，計(jì)算方法如下：腫瘤最大相對灌注量=腫瘤最大灌注區(qū)平均值/對側(cè)大腦半球灰質(zhì)平均值×100%。

1.3 MVD表達(dá)的免疫組化檢測與結(jié)果判定

1.3.1 檢測方法

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(S-P)法檢測膠質(zhì)瘤組織中MVD表達(dá)，其中MVD用CD31來標(biāo)記。

1.3.2 主要試劑

小鼠抗人CD31單克隆抗體、S-P超敏試劑盒及DAB試劑盒均購自中杉生物技術(shù)公司。

1.3.3 結(jié)果判定

由兩位神經(jīng)病理科醫(yī)師進(jìn)行分析，膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。MVD的計(jì)數(shù)采用Weidner法[8]，將切片置于40倍顯微鏡下確定最高血管密度區(qū)域，即熱點(diǎn)區(qū)，再于400倍視野下計(jì)數(shù)，選擇5個(gè)最高血管密度區(qū)進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，然后求其平均值作為該病例的MVD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤rCBFmax值與膠質(zhì)瘤級(jí)別

隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高，腫瘤平均rCBFmax值升高。本研究中低級(jí)別膠質(zhì)瘤組平均rCBFmax值(1.69±1.27)低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(3.18±1.46)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。腫瘤rCBFmax值與膠質(zhì)瘤級(jí)別呈正相關(guān)(r=0.620，P＜0.01)，見圖1、2，表1。

2.2 MVD值與膠質(zhì)瘤級(jí)別

表1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤rCBFmax值與MVD表達(dá)關(guān)系Tab.1 The rCBFmax and MVD differences of astrocytoma

隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高，腫瘤平均MVD值升高。本研究中低級(jí)別膠質(zhì)瘤平均MVD值(25.43±13.03)明顯低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(58.69±20.39)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且與級(jí)別呈正相關(guān)(r=0.698，P＜0.01)，見圖1、2，表1。

圖1 男，72歲，右側(cè)顳葉膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO Ⅳ級(jí))。A ：T1WI增強(qiáng)圖，右側(cè)顳葉腫瘤(箭)；B：3D-ASL CBF圖，腫瘤實(shí)性部分rCBFmax值為3.17；C：MVD免疫組化染色圖，平均MVD值為101.4 圖2 女，38歲，右側(cè)額葉彌漫性星形細(xì)胞瘤(WHO Ⅱ級(jí))。A ：T1WI增強(qiáng)圖，右側(cè)額葉腫瘤(箭)，增強(qiáng)后未見明顯強(qiáng)化；B：3D-ASL CBF圖，腫瘤實(shí)性部分rCBFmax值為1.89；C：MVD免疫組化染色圖，平均MVD值為12.3Fig. 1 Seventy-two years old man, a histologically verified grade Ⅳ glioblastoma in the right temporal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right temporal lobe tumor (arrow); B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 3.17; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 101.4. Fig. 2 Thirty-eight years old woman, a histologically verified grade Ⅱ diffuse astrocytoma in the right frontal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right frontal lobe tumor (arrow), there was no obvious enhancement after enhancement; B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 1.89; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 12.3.

圖3 膠質(zhì)瘤rCBFmax值與MVD表達(dá)相關(guān)性的線性回歸圖Fig. 3 Linear regression diagram correlation between rCBFmax value and MVD of gliomas.

2.3 腫瘤rCBFmax值與MVD相關(guān)性

腫瘤rCBFmax值與MVD值呈正相關(guān)(r=0.723，P＜0.01)，見圖3。

3 討論

3.1 rCBFmax值與膠質(zhì)瘤級(jí)別的關(guān)系

ASL技術(shù)是一項(xiàng)新興的磁共振功能檢查技術(shù)，具有無輻射、無創(chuàng)、可重復(fù)性、無需注射對比劑等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合用于老人、小孩及腎功能不全的患者[2，9]，多項(xiàng)研究證實(shí)其可取代傳統(tǒng)的動(dòng)態(tài)磁敏感對比增強(qiáng)法對膠質(zhì)瘤內(nèi)部微血管灌注進(jìn)行評(píng)價(jià)[10-12]。眾所周知，腫瘤的生長與微血管生成密切相關(guān)，腫瘤的微血管密集程度是惡性腫瘤分級(jí)的最重要標(biāo)準(zhǔn)之一。病理學(xué)是評(píng)價(jià)微血管密度的金標(biāo)準(zhǔn)，但是屬于有創(chuàng)性檢測。常規(guī)MR增強(qiáng)反映的是血腦屏障的破壞，不能準(zhǔn)確顯示腫瘤內(nèi)部微血管豐富或密集程度，觀察到的腫瘤強(qiáng)化部分也不能代表腫瘤惡性程度最高的部分，從而對膠質(zhì)瘤術(shù)前分級(jí)存在誤判。而ASL技術(shù)的主要參數(shù)rCBFmax值顯示的是腫瘤微血管灌注情況，從而間接反映腫瘤微血管密集程度，對術(shù)前無創(chuàng)性預(yù)測膠質(zhì)瘤級(jí)別準(zhǔn)確性較高；并且由于膠質(zhì)瘤的異質(zhì)性，腫瘤內(nèi)部微血管灌注往往不均勻，同一膠質(zhì)瘤不同部位取材可能最后病理結(jié)果并不一致，筆者采用熱點(diǎn)法[7]所測rCBFmax值是腫瘤內(nèi)部微血管最為密集之處，理論上對應(yīng)膠質(zhì)瘤內(nèi)部惡性程度最高部分，從而更準(zhǔn)確預(yù)測膠質(zhì)瘤分級(jí)。本研究筆者選用相對灌注量而非絕對灌注量，是因?yàn)閺睦碚撋蟻碚f，雖然絕對灌注量可通過ASL方法測定，但是實(shí)際應(yīng)用中有很多不穩(wěn)定因素影響測值，比如組織和血液的弛豫時(shí)間不同及病理狀態(tài)等。因此通過使用ASL測量的CBF值被認(rèn)為是成比例，而不是等同于實(shí)際局部CBF值，所以用相對血流量來表述更為恰當(dāng)。需要指出的是，之所以選擇腫瘤最大灌注值，是由膠質(zhì)瘤內(nèi)部異質(zhì)性與不均質(zhì)性決定的，此處對應(yīng)血管最為密集，相對病理學(xué)分級(jí)最高，此與病理學(xué)測定方法也是一致的。曲源等[13]研究表明高級(jí)別膠質(zhì)瘤的CBF值顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤；董衛(wèi)敏等[2]研究表明高低級(jí)別膠質(zhì)瘤組最大腦血流量、對側(cè)正?；屹|(zhì)腦血流量的平均值分別為2.13±1.14、0.79±0.40，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；李銳等[14]研究表明高低級(jí)別膠質(zhì)瘤組rCBFmax-ASL值分別為2.57±0.16、1.16±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；張玉琴等[15]研究結(jié)果為高低級(jí)別膠質(zhì)瘤CBF值患側(cè)/健側(cè)比值分別為3.11±1.45、0.86±0.28，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中低級(jí)別膠質(zhì)瘤組平均rCBFmax值(1.69±1.27)明顯低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(3.18±1.46)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腫瘤rCBFmax值與膠質(zhì)瘤級(jí)別呈正相關(guān)，說明腫瘤平均rCBFmax值可用于膠質(zhì)瘤內(nèi)部微血管灌注情況的評(píng)價(jià)，進(jìn)而反映膠質(zhì)瘤級(jí)別，并且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別升高而數(shù)值有增高趨勢，此與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致[2，13-15]。

3.2 MVD值與膠質(zhì)瘤級(jí)別關(guān)系

CD31是一種跨膜糖蛋白[3]，屬于免疫球蛋白超級(jí)家族成員，主要分布在脈管細(xì)胞如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞細(xì)胞表面，尤其在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接處有高水平表達(dá)，與血管形成關(guān)系密切，因此可作為內(nèi)皮細(xì)胞特異的標(biāo)記物。病理上即可使用CD31標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞來計(jì)算MVD，從而評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤級(jí)別。張旭標(biāo)等[4]對44例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本采用免疫組化染色法與雙重免疫熒光組化染色法對血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中CD31陽性表達(dá)率明顯高于Ⅱ級(jí)病變組織。王建禎等[3]用Northern雜交和免疫組化法檢測50例膠質(zhì)瘤，結(jié)果顯示低級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中陽性血管數(shù)量明顯少于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組，CD31在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而增加。本研究中低級(jí)別膠質(zhì)瘤平均MVD值(25.43±13.03)明顯低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(58.69±20.39)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與級(jí)別呈正相關(guān) 。此與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3-4]。

3.3 rCBFmax值與MVD值表達(dá)間關(guān)系

本組病例結(jié)果顯示腫瘤rCBFmax值與MVD值呈正相關(guān)，說明rCBFmax值反映的是微血管灌注情況，能更直觀反映腫瘤內(nèi)部微血管的形成情況，預(yù)測腫瘤微血管密度，為腫瘤術(shù)前分級(jí)提供參考。國內(nèi)外已有文獻(xiàn)研究ASL相關(guān)參數(shù)rCBFmax值與腦腫瘤微血管密度之間的關(guān)系[7，16]，結(jié)果證實(shí)rCBFmax值可預(yù)測腫瘤微血管密度，可用于膠質(zhì)瘤的術(shù)前分級(jí)(低級(jí)別與高級(jí)別)，此與本研究結(jié)果一致。

3.4 不足之處

本研究的不足之處在于ASL技術(shù)圖像空間分辨率較低，采集時(shí)間較長，缺乏圖像上rCBFmax值測值點(diǎn)與病理標(biāo)本的點(diǎn)對點(diǎn)對照分析，并且樣本量仍偏少，未按照各級(jí)別膠質(zhì)瘤來細(xì)分，有待加大樣本量并以rCBFmax值來指導(dǎo)病理取材并進(jìn)一步研究。