Krüppel樣因子對腎臟疾病的調(diào)控作用

1950年，Gloor發(fā)現(xiàn)了一種能導(dǎo)致果蠅身體嚴(yán)重畸形的突變，命名為Krüppel，意為“跛子”。隨后，Nüsslein-Volhard和Wieschaus發(fā)現(xiàn)Krüppel突變在胚胎發(fā)育早期阻礙果蠅體細(xì)胞分裂，具胚胎致死性[1]。哺乳動物基因組中與Krüppel同源的基因被稱為Krüppel樣因子(KLF)，其羧基末端高度保守，具有三個串聯(lián)的Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)，通過與富含GC的DNA序列相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性。

人類基因組包含17個KLF編碼基因，根據(jù)功能差異可分為三組：第1組為轉(zhuǎn)錄抑制因子，KLF3、-8和-12；第2組為轉(zhuǎn)錄激活因子，KLF1、-2、-4、-5、-6和-7；第3組的KLF能結(jié)合并增強共抑制蛋白SIN3A活性，KLF9、-10、-11、-13、-14和-16；而KLF15和KLF17因功能尚未完全闡明，未被進行歸類[2]。除KLF1僅特異性表達(dá)于造血細(xì)胞，其他家族成員廣泛表達(dá)。KLFs的生物功能具有高度多樣性，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，分化和死亡; 內(nèi)皮和上皮功能; 脂肪和糖代謝和線粒體功能等[2]。近來，KLFs在腎臟中的表達(dá)和功能被廣泛研究，顯微切割腎單位的不同節(jié)段并進行基因表達(dá)譜深度測序，揭示了KLFs在腎單位不同節(jié)段的表達(dá)模式，越來越多的研究關(guān)注KLFs在腎臟中的功能。

KLFs在腎單位發(fā)育中作用

KLFs作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和程序性死亡，最初發(fā)現(xiàn)果蠅KLF純合突變導(dǎo)致胚胎胸部和前腹部發(fā)育異常，隨后在哺乳動物小鼠中發(fā)現(xiàn)，紅系Krüppel樣因子(EKLF)對胚胎肝臟紅細(xì)胞生成的最后步驟至關(guān)重要，EKLF-/-純合小鼠將發(fā)生致命的β地中海貧血[3]。此外，KLF4表達(dá)與生長停滯有關(guān)，最早發(fā)現(xiàn)在生長停滯的小腸上皮細(xì)胞中差異表達(dá)[4]，隨后證實其在多種上皮細(xì)胞中通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S停滯起負(fù)性調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[5]。

在腎臟發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、p53和KLF4及共激活因子CREB結(jié)合蛋白(CBP)之間協(xié)同相互作用，調(diào)控緩激肽B2受體(B2R)基因的表達(dá)，進而調(diào)控腎單位的終末分化和正常功能[6]。小鼠胚胎發(fā)育早期，Klf6在Wolffian導(dǎo)管、輸尿管芽、集合管和系膜中選擇性表達(dá)，這種表達(dá)模式表明Klf6可能在腎臟，特別是腎臟集合管系統(tǒng)的發(fā)育中起作用[7]。此外，KLF12表達(dá)于遠(yuǎn)端小管中，特別是內(nèi)髓集合管，參與了出生后集合管的成熟，研究發(fā)現(xiàn)KLF12在出生后15d開始上調(diào)并通過增強尿素轉(zhuǎn)運蛋白A1(UT-A1)而非上皮鈉通道(ENaC)的啟動子活性來調(diào)控其表達(dá)[8]。

KLFs與腎小球損傷

腎小球濾過功能障礙是慢性腎臟病的主要特征之一，足細(xì)胞是具有有限復(fù)制能力的高度分化和生長停滯的細(xì)胞，維持腎小球濾過屏障的完整性，其損傷參與多種腎臟疾病進程，如局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、HIV相關(guān)性腎病(HIVAN)和糖尿病腎病等。足細(xì)胞特異基因和裂孔膜相關(guān)基因的啟動子保守性分析顯示存在共同的KLF結(jié)合位點，提示KLF家族蛋白在特異性調(diào)控足細(xì)胞功能中的潛在作用[9]。

KLF15也稱腎臟富集的KLF，是一種足細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子，KLF15基因缺陷將導(dǎo)致足細(xì)胞損傷易感性增加[10]。ChIP結(jié)果顯示KLF15能夠通過結(jié)合足細(xì)胞表面標(biāo)志物(nephrin、synaptopodin和podocin)的啟動子區(qū)，誘導(dǎo)足細(xì)胞分化，作為關(guān)鍵調(diào)控因子參與維甲酸的腎臟足細(xì)胞保護過程[10]。糖皮質(zhì)激素(GC)是治療原發(fā)性腎小球病變的主要治療手段，可誘導(dǎo)KLF15表達(dá)并增加糖皮質(zhì)激素受體與KLF15啟動子的親和性，參與激素介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷修復(fù)過程。此外，腎小球中KLF15的低表達(dá)與原發(fā)性FSGS和微小病變患者的激素抵抗相關(guān)，提示其可作為預(yù)測GC治療反應(yīng)性的潛在標(biāo)志物[11]。

線粒體穩(wěn)態(tài)對維持高能量代謝需求的足細(xì)胞正常功能至關(guān)重要，對HIV感染的足細(xì)胞和HIV轉(zhuǎn)基因小鼠腎小球轉(zhuǎn)錄本進行分析，發(fā)現(xiàn)KLF家族成員中僅KLF6表達(dá)發(fā)生顯著改變且呈明顯低表達(dá)。特異性足細(xì)胞Klf6敲除的C57BL/6小鼠品系具有FSGS易感性[12]，KLF6調(diào)控線粒體細(xì)胞色素C裝配基因SCO2，是一種早期損傷應(yīng)答基因，對應(yīng)激時維持線粒體功能、防止細(xì)胞色素C釋放和內(nèi)源性凋亡途徑激活至關(guān)重要[12]。

KLF4與其他3種多能重編程因子(OCT4，SOX2和c-MYC)的異位表達(dá)能誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)。腎臟中，KLF4表達(dá)于足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)蛋白尿小鼠模型和腎病綜合征患者腎活檢組織中KLF4表達(dá)降低[13]。通過Klf4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和足細(xì)胞特異性四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)恢復(fù)阿霉素腎病(ADR)小鼠的Klf4表達(dá)，或使用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)治療后，能抑制nephrin啟動子的甲基化并減少小鼠尿蛋白，提示KLF4對足細(xì)胞特異基因的表觀調(diào)控作用[13]。

KLF6和KLF15在系膜細(xì)胞中也發(fā)揮重要功能。在后腎發(fā)育過程中，Klf6表達(dá)于Wolffian導(dǎo)管和輸尿管芽及其分支，分化早期階段小球中并不表達(dá)，但隨著不斷發(fā)育在毛細(xì)血管階段可表達(dá)于小球系膜細(xì)胞[7]。在C5b-9復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞損傷中，ATF3可通過上調(diào)KLF6和Gadd45α的表達(dá)參與系膜細(xì)胞凋亡[14]。此外，在Thy-1大鼠模型中，KLF15可能通過E2F1調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(CDK2和cyclin D1)的表達(dá)抑制系膜細(xì)胞增殖，提示其可成為系膜增生性腎小球腎炎治療干預(yù)的潛在靶點[15]。

KLFs與腎小管間質(zhì)病變及纖維化

CLC-K1和CLC-K2是在大鼠腎臟特異表達(dá)的CLC型氯離子通道，稱為CLC-K，主要分布于髓袢，KLF15通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控myc相關(guān)鋅指蛋白(MAZ)抑制CLC-K1和CLC-K2氯離子通道的表達(dá),故KLF15蛋白定位于在不表達(dá)CLC-K的腎臟細(xì)胞中[16]。KLF12也表達(dá)于遠(yuǎn)端小管中，特別是內(nèi)髓集合管，參與了出生后集合管的成熟[8]。然而，目前尚不明確KLF12或KLF15是否參與氯化物或尿素轉(zhuǎn)運。此外，Lee等[17]的基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，與其他KLFs相比，KLF9和KLF10在腎單位的部分節(jié)段中顯著高水平表達(dá)。在體外培養(yǎng)的小鼠遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞中KLF9為鹽皮質(zhì)激素受體的潛在下游靶點，但仍需進一步的研究來評估這些鋅指蛋白是否參與腎臟離子通道病變。

TGF-β信號是上皮細(xì)胞周期阻滯和上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)的共同調(diào)節(jié)因子，KLF4與 TGF-β呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)的特性。一方面，在高糖刺激的人近端腎小管細(xì)胞中過表達(dá)KLF4，能抑制TGF-β介導(dǎo)的炎癥相關(guān)蛋白巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)表達(dá)的增加[18]。在巨噬細(xì)胞中，KLF4能與Smad3競爭共激活因子p300/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，從而抑制TGF-β轉(zhuǎn)錄。另一方面，KLF4的功能受轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，TGF-β1通過經(jīng)典和非經(jīng)典途徑誘導(dǎo)血管平滑肌中KLF4磷酸化，形成KLF4-Smad2 復(fù)合物，共激活TGF-β1受體[19]。TGF-β還能通過Cdh1/APC信號通路介導(dǎo)KLF4的泛素化和蛋白酶體的降解[20]。此外，體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)Dnmt1參與TGF-β1介導(dǎo)的KLF4啟動子甲基化過程，促進腎臟上皮細(xì)胞的EMT，而過表達(dá)KLF4能誘導(dǎo)E-cadherin和ZO-1的表達(dá)，下調(diào)α-SMA和成纖維細(xì)胞特異蛋白-l(FSP-1)表達(dá)，從而抑制EMT過程[21]。

KLF5主要在集合管上皮細(xì)胞中表達(dá)，與CCAAT增強子結(jié)合蛋白(C/EBPα)協(xié)同作用參與炎癥和纖維化過程。Klf5+/-單倍劑量不足的小鼠在單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后表現(xiàn)為腎臟保護作用，伴隨巨噬細(xì)胞M1型向M2型的明顯轉(zhuǎn)變，腎臟纖維化較輕[22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻模型中基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)Klf5/Klf4表達(dá)，增加小鼠近端腎小管細(xì)胞的基質(zhì)硬度導(dǎo)致Klf5的顯著上調(diào)伴隨Klf4的下調(diào)，參與腎纖維化進程。基質(zhì)剛度增加時，可激活ERK信號，誘導(dǎo)Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)核移位并阻礙KLF5降解，而降低基質(zhì)剛度則直接抑制ERK/YAP1/Klf5/cyclin D1軸。

除調(diào)控足細(xì)胞中線粒體功能外，KLF6還表達(dá)于腎近端小管細(xì)胞。KLF6可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肝纖維化中的TGF-β表達(dá)。在糖尿病Ren-2大鼠模型和高糖刺激的近端小管細(xì)胞中Klf6表達(dá)增加，在體外培養(yǎng)的近端小管細(xì)胞中過表達(dá)Klf6，能促進TGF-β1表達(dá)并且促進EMT[24]。

KLF15在高蛋白飲食喂養(yǎng)的5/6腎切除大鼠的腎間質(zhì)中低表達(dá)，限制蛋白飲食能增加KLF15的表達(dá)，減輕5/6腎切除大鼠腎纖維化[25]。體外研究已證實KLF15能通過ERK/MAPK和JNK/MAPK信號通路抑制TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抗纖維化作用[26]。這些研究均表明KLFs在腎纖維化中發(fā)揮重要作用。

KLFs與腎血管損傷

KLF家族在內(nèi)皮生物學(xué)功能中存在一些重疊，但它們在調(diào)節(jié)關(guān)鍵下游靶標(biāo)的機制不盡相同。KLF2和KLF4轉(zhuǎn)錄因子是內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，由于存在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，二者在維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)方面功能相似[27]。KLF2和KLF4均為小鼠胚胎血管生成的關(guān)鍵因子，在胚胎發(fā)生過程中Klf2和Klf4單敲和雙敲動物模型都存在不同程度的血管損傷。此外，炎性細(xì)胞因子和非層流血流誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙并促粘連和促血栓形成，而KLF4和KLF2在上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，參與抗炎和抗血栓[27]。

過表達(dá)Klf4的內(nèi)皮細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄譜分析顯示，多個差異基因參與內(nèi)皮功能炎癥、血栓形成、血管舒縮、血管發(fā)育和氧化應(yīng)激。在缺血再灌注腎損傷模型中KLF4對急性腎損傷(AKI)具有內(nèi)皮保護作用，內(nèi)皮細(xì)胞Klf4敲除增加炎癥和黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)表達(dá)，加重AKI[28]。此外KLF4還參與他汀類藥物抗缺血性AKI的保護作用，內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4能直接抑制p65調(diào)節(jié)NF-κβ通路，下調(diào)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和改善炎癥細(xì)胞浸潤[28]。

Klf2于哺乳動物胚胎8.5d開始表達(dá)，內(nèi)皮特異性Klf2基因敲除小鼠由于喪失血管完整性，死于出血和高輸出性心力衰竭[29]。在體外暴露于層流切變應(yīng)力的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，能激活ERK5信號通路，上調(diào)KLF2和其下游分子內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(eNOS)、血栓調(diào)節(jié)素(THBD)和內(nèi)皮素1(ET-1)表達(dá)，提示KLF2的內(nèi)皮保護作用[30]。在人類糖尿病腎活檢樣本和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中，腎小球KLF2表達(dá)明顯降低。特異性內(nèi)皮細(xì)胞Klf2敲除的雜合小鼠在STZ誘導(dǎo)糖尿病腎病模型中表型更重，表現(xiàn)為蛋白尿、小球肥大和內(nèi)皮損傷均更重，有趣的是足細(xì)胞損傷也更為突出[31]。他汀類藥物治療小鼠缺血再灌注損傷也能誘導(dǎo)KLF2表達(dá)[32]。

腎移植后，由于抗體介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑毒性，可能繼發(fā)血栓性微血管病，腎移植后介導(dǎo)內(nèi)皮損傷的機制仍然知之甚少。在非典型溶血性尿毒癥的小球轉(zhuǎn)錄本分析中，KLF2的表達(dá)輕度升高，然而腎移植相關(guān)血栓性微血管病的小球轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn)KLF2和KLF4均降低[33]，提示KLF介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控更為復(fù)雜。

KLFs與免疫調(diào)節(jié)

小鼠的基因靶向敲除研究揭示了KLFs在髓系和淋巴系細(xì)胞成熟中的生理作用，多個KLF家族成員是T細(xì)胞運輸、T調(diào)節(jié)細(xì)胞分化或抑制功能、單核/巨噬細(xì)胞以及B記憶細(xì)胞成熟、激活和更新等重要信號通路的下游靶標(biāo)。

KLF2和KLF4均在T細(xì)胞中表達(dá)，參與免疫調(diào)控。KLF2可促進小鼠誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞(iTregs)的產(chǎn)生，可作為治療腎移植后細(xì)胞排斥的潛在靶標(biāo)[34]。KLF4是小鼠巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)KLF4與Stat6協(xié)同作用誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，并通過螯合NF-κB活化所需的共激活因子來抑制M1型巨噬細(xì)胞的活化，且KLF4缺陷的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎癥基因上調(diào)[35]。

表1 KLFs表達(dá)模式和功能

小結(jié):KLFs在維持腎臟穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮多方面的作用，且相互作用。既往研究關(guān)注KLFs在發(fā)育和再生中的重要作用，近年來研究提示KLFs同時也參與腎小球疾病、炎癥、腎纖維化和血管損傷，而這些鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、調(diào)控和功能在腎臟生理病理中發(fā)揮的重要作用還有待研究者們進一步探索。