黃芩素促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢參與潰瘍性結(jié)腸炎治療的研究

陳敬根，周 凌，汪 渝，張 奎

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一類由包括遺傳、環(huán)境等多種因素參與的自身免疫疾病，屬于炎癥性腸病的一種，但病因尚不明確[1]。UC主要累及乙狀結(jié)腸，病理表現(xiàn)為淺表結(jié)腸組織發(fā)生彌漫、連續(xù)性潰瘍糜爛[2]。目前，臨床上主要采用激素或免疫抑制劑類藥物對該病進(jìn)行治療[3]。但此類治療方法均無法根治，近年來，以間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療為主的細(xì)胞療法在包括UC在內(nèi)自身免疫疾病的治療中逐漸得到重視[4]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具備自我更新能力的多潛能干細(xì)胞，研究表明，其可通過影響固有免疫細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。因此，該細(xì)胞類型已被研究用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)等多種自身免疫疾病，并取得較好的治療效果[6-7]。最近研究表明，某些中藥成分具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢作用，可發(fā)揮增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的效果[8]。因此，本課題通過研究黃芩素對間充質(zhì)干細(xì)胞向大鼠潰瘍性結(jié)腸炎病損部位歸巢作用的影響，為該藥物作為輔助間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療潰瘍性結(jié)腸炎的可行性奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 6周齡的雌性SD大鼠，購自南京模式動物研究中心；黃芩素(20 mg，F(xiàn)Y12960708)購自南京飛宇生物科技有限公司。抗Musashi-1抗體購自Abcam，美國(ab129819)；抗Lgr5抗體購自Santa，德國(sc-68580)；抗Ephrin B3抗體購自Abcam，美國(ab101699)。

1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞提取、鑒定及體外黃芩素預(yù)處理 腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死大鼠，分離股骨及脛骨并置于75%乙醇5 min。無菌條件下，使用M199培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集洗滌液并重懸為單細(xì)胞懸液。1 500 r/min 5 min離心單細(xì)胞懸液后棄去上清。隨后用含10%FBS及1%雙抗的M199培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后，進(jìn)行接種培養(yǎng)。間隔3～4 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞長至90%培養(yǎng)瓶底面積時行細(xì)胞傳代。

取第3代細(xì)胞，利用0.25%胰蛋白酶消化80%融合的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，并重懸為1×106/L的細(xì)胞懸液。吸取100 μl上述細(xì)胞懸液于兩個EP管中，并分別加入PE標(biāo)記的抗CD45及CD59抗體。室溫孵育30 min后行流式細(xì)胞術(shù)檢測。上述細(xì)胞重懸1×106/L的細(xì)胞懸液后分為2組：空白組及黃芩素處理組。在細(xì)胞增殖至50%密度時，黃芩素處理組加入1 ml含黃芩素的完全培養(yǎng)基至藥物終濃度為100 ng/ml，空白組加入1 ml完全培養(yǎng)基。隨后共培養(yǎng)24 h。

1.3 潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建及分組 利用TNBS灌腸法制作大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。大鼠造模前禁食1 d，水合氯醛麻醉后大鼠直腸注入造模液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 ml)，誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模成功后，將40只大鼠隨機(jī)分為4組(空白組、模型組、MSCs組及黃芩素干預(yù)MSCs組)，其中空白組不造UC模型。模型組及空白組分別經(jīng)尾靜脈注射1 ml PBS，MSCs組經(jīng)尾靜脈注射1 ml細(xì)胞懸液(1.0×106個)，黃芩素干預(yù)MSCs組經(jīng)尾靜脈注射1 ml黃芩素處理后的細(xì)胞懸液(1.0×106個)。

1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢效果評估

1.4.1 免疫組化法檢測干細(xì)胞標(biāo)志物Musashi-1的表達(dá) 大鼠尾行靜脈注射后每隔5 d處死3只大鼠，收集結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟切片。常規(guī)利用二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水，加入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)，并于微波爐內(nèi)微波輻射10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗5次后，山羊血清進(jìn)行室溫封閉10 min，隨后加入一抗(抗Musashi-1) 4 ℃過夜；PBS洗滌后，加入生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min后加入顯色劑(DAB)，流水沖洗后封片觀察。采用半定量積分法計(jì)算染色積分，即分別對陽性細(xì)胞數(shù)及其著色程度進(jìn)行分級計(jì)分，結(jié)果以2項(xiàng)之積表示。陽性細(xì)胞率：每張切片隨機(jī)檢測5個視野(400×)，所見的陽性細(xì)胞分為0～4級(共5級)：0級為陰性，記0分；1級陽性細(xì)胞占1%～25%，記1分；2級陽性細(xì)胞占26%～50%，記2分；3級陽性細(xì)胞占51%～75%，記3分；4級陽性細(xì)胞占76%～100%，記4分。

1.4.2 Western blot法檢測Lgr5和Ephrin-B3在結(jié)腸的表達(dá)水平 隨機(jī)抽取不同部位的腸黏膜組織20 mg，裂解并提取結(jié)腸組織中的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白上清與蛋白上樣緩沖液構(gòu)成40 μl體系，在變性條件下進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；PBST洗3次，5 min/次；加入抗Lgr5抗體、抗Ephrin B3抗體，室溫孵育1 h；PBST洗3次，5 min/次；加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；洗膜后ECL顯色。結(jié)果采用Image J進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定 骨髓提取的間充質(zhì)單細(xì)胞傳代培養(yǎng)3次后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。流式結(jié)果表明，經(jīng)過提取及傳代培養(yǎng)后，91.6%的細(xì)胞表面有CD90的表達(dá)，而CD45的表達(dá)量僅為3.98%，表明本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞屬于CD90+/CD45-的干細(xì)胞。見圖1。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

2.2 免疫組化分析腸道干細(xì)胞標(biāo)志物Musashi-1的表達(dá)情況 對結(jié)腸切片進(jìn)行免疫組化染色，Musashi-1染色積分值及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如表1、圖2所示。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在尾靜脈注射后第5天，模型組的Musashi-1積分值低于黃芩素干預(yù)MSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.402，P=0.043)；但黃芩素干預(yù)MSCs組的Musashi-1積分值與MSCs組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.271，P=0.240)。給藥后第10天，黃芩素干預(yù)MSCs組的Musashi-1積分值高于第10天模型組及MSCs組的積分值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.854，P<0.001；t=3.348，P=0.010)。

表1 各組間Musashi-1的表達(dá)情況分析(n=5)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MSCs組比較，#P<0.05

2.3 Western blot檢測Lgr5和Ephrin-B3在結(jié)腸的表達(dá)水平 見圖3、圖4。應(yīng)用Western blot檢測各組大鼠結(jié)腸組織在不同時間點(diǎn)Lgr5和Ephrin-B3表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示，黃芩素干預(yù)MSCs組結(jié)腸組織的Lgr5和Ephrin-B3表達(dá)量高于空白組、模型組、MSCs組。

圖2 各組大鼠腸道Musashi-1免疫組化染色結(jié)果

圖3 各組結(jié)腸組織Lgr5和Ephrin-B3表達(dá)水平

圖4 各組結(jié)腸組織Lgr5和Ephrin-B3相對表達(dá)水平

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道處于反復(fù)炎癥狀態(tài)，因此被認(rèn)為是一種難治性癌前病變。此類患者的結(jié)腸黏膜組織受到反復(fù)破壞的同時，也伴隨著機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能失衡，因此，糾正失調(diào)的免疫功能并修復(fù)受損腸黏膜屏障是治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵[9-13]。中醫(yī)理論認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎屬于“痢疾”、“久痢”和“腸澼”等范疇[14]，包括黃芩湯在內(nèi)的多種方劑均可治療該病，并取得了良好效果[15]。但黃芩湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥理機(jī)制不明，因此，本研究選擇黃芩湯的主要藥理成分黃芩素作為研究對象，從間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢角度，初步分析黃芩素在治療潰瘍性結(jié)腸炎中的可能機(jī)制，為今后深入研究其藥理作用奠定前期研究基礎(chǔ)。

間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多潛能干細(xì)胞，存在于包括臍帶血及骨髓等多種組織器官內(nèi)，在適當(dāng)環(huán)境下可分化為多種三胚層細(xì)胞，參與機(jī)體組織修復(fù)過程[4]。本研究經(jīng)由骨髓中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用其貼壁生長的特點(diǎn)選用經(jīng)3次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，骨髓來源MSCs呈現(xiàn)貼壁生長的特性。公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞表面存在多種分子標(biāo)志，包括CD90、CD105、CD166等抗原陽性，以及CD45、CD14、CD34等抗原陰性。本研究選取CD90+及CD45-作為表面特異分子標(biāo)志[16]。流式結(jié)果表明，經(jīng)3代傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞表面CD90、CD45的陽性率分別為91.6%、3.98%，呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)(CD90+/CD45-)，可用于后期尾靜脈回輸實(shí)驗(yàn)。

成體干細(xì)胞是治療潰瘍性結(jié)腸炎的首選細(xì)胞，主要存在于結(jié)腸隱窩基底部，但該細(xì)胞難以獲得及體外擴(kuò)增困難的特點(diǎn)導(dǎo)致其無法用于臨床治療。因此，目前研究主要集中在造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCT)及MSCs移植的研究上。MSCs具有向病損部位歸巢的特性，在病灶部位聚集后可參與靶組織的修復(fù)過程。但MSCs向腸道的歸巢效率較低，有研究表明，靜脈注射人干細(xì)胞到裸鼠體內(nèi)后，僅0.13%的干細(xì)胞可在小鼠腸道組織中被檢測到[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在尾靜脈注射未處理的MSCs后的第5天及第10天，腸道干細(xì)胞標(biāo)志物Musashi-1與空白組及模型組無顯著性差異，表明未經(jīng)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至受損腸道組織并分化為腸道干細(xì)胞的數(shù)量較少，與既往研究相符。但黃芩素干預(yù)MSCs組的大鼠結(jié)腸組織的Musashi-1在不同時間點(diǎn)(第5、10天)均高于MSCs組，初步提示黃芩素可促進(jìn)MSCs歸巢及向腸干細(xì)胞分化，發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

Lgr5和Ephrin-B3是未成熟的腸黏膜細(xì)胞標(biāo)志物，其中Lgr5表達(dá)在腸分泌細(xì)胞的前體，腸分泌細(xì)胞可通過分泌黏液對腸道起潤滑作用，對腸黏膜屏障的構(gòu)成具有重要意義。而Ephrin-B3則是一種表達(dá)結(jié)腸隱窩底部的標(biāo)記物，在潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸組織中隱窩被嚴(yán)重破壞，抑制原有腸干細(xì)胞對受損結(jié)腸組織的修復(fù)[18]。Western blot結(jié)果顯示，黃芩素干預(yù)MSCs組的Lgr5和Ephrin-B3表達(dá)水平均明顯高于其他各組，提示尾靜脈輸注黃芩素干預(yù)MSCs，可促進(jìn)腸分泌細(xì)胞的分化，并且對結(jié)腸隱窩的重建亦有促進(jìn)作用。

同時，本研究也存在一些不足。黃芩素對于MSCs增殖、分化能力的影響也可能是其發(fā)揮促進(jìn)MSCs歸巢的潛在基礎(chǔ)，因此，應(yīng)針對黃芩素對MSCs的直接影響開展研究；并且本研究尚缺乏大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀改善程度的評估，也需后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，黃芩素可通過促進(jìn)MSCs向結(jié)腸組織歸巢來參與腸道黏膜屏障的重建，并發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。