新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇預防糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的實驗研究

周開珩

0 引言

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)作為糖尿病的一種嚴重的心血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚不明確[1]。研究顯示，糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)性的高血糖癥能夠?qū)е滦募〖毎a(chǎn)生過量的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，引起脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗及心肌細胞鈣離子調(diào)節(jié)異常，最終導致心肌細胞凋亡，左心室收縮、舒張功能障礙，且沒有有效的防治方法[2]。

白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)作為一類多酚類抗毒素，最早發(fā)現(xiàn)存在于葡萄皮及紅酒中。國外研究顯示，長期給予白藜蘆醇能夠明顯增加糖尿病大鼠心肌抗氧化蛋白的表達，有效減少心肌的凋亡及梗死面積，從而保護糖尿病大鼠心臟[3-4]。同時，有報道，糖尿病大鼠口服白藜蘆醇2周后，心肌細胞對葡萄糖的攝取及利用明顯增加[5]。另外，Zhang等[6]研究顯示，糖尿病大鼠口服白藜蘆醇20 mg/(kg·d)4周后，大鼠左心室收縮功能明顯提高。因此，白藜蘆醇作為一種安全、有效的天然化合物，可通過抗炎、抗感染、抗氧化應激等發(fā)揮改善糖尿病心血管病的作用[7-9]。但是作為難溶性化合物，白藜蘆醇溶解度低(50 μg/ml)，且穩(wěn)定性差，高溫、強光、pH變化會導致其分解，因此，其在體應用存在劑量低、無法滿足正常治療劑量及潛在安全性等問題[10]。

納米脂質(zhì)體作為一種新型的藥物遞送載體，具有良好的生物相容性、減少包封藥物毒性、增加藥物穩(wěn)定性及濃度等性質(zhì)，已經(jīng)廣泛用于難溶性及不穩(wěn)定性藥物的遞送[11]。

目前國內(nèi)外沒有應用納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇預防糖尿病心肌病的相關實驗研究。因此，本次研究采用新型的納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇，從而增加其溶解度及穩(wěn)定性，并以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的1型糖尿病大鼠為實驗動物模型，應用透射電鏡觀察、TUNEL凋亡染色結合Western blot技術，綜合考察包載白藜蘆醇納米脂質(zhì)體對于糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，體重180～220 g，清潔級，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 儀器與試劑 白藜蘆醇(Sigma-Aldrich公司)，混合磷脂S75(德國Lipoid GmbH公司)，ATX Tris 緩沖液及油酸(Sigma-Aldrich公司)，戊巴比妥鈉(上海西唐生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素STZ (Sigma-Aldrich公司)，TUNEL凋亡試劑盒(Roche Applied Science)，AKT蛋白、PAKT一抗(Cruz Biotechnology)，血糖試紙(德國羅氏活力型血糖儀專用試紙)。

1.3 實驗方法

1.3.1 新型白藜蘆醇納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)考察 參考Caddeo等[10]報道的白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備方法。將白藜蘆醇2.5 mg，混合磷脂S75 120 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 緩沖液，避光過夜，形成混合溶液，將上述溶液在冰浴條件下應用超聲勻漿機進行超聲處理，形成載藥脂質(zhì)體(2.5 mg/ml)。超聲條件：持續(xù)超聲5 s，停2 s，連續(xù)循環(huán)45次，超聲探頭振幅13 μm，所有操作均在避光條件下進行。按照上述方法制備空白脂質(zhì)體白藜蘆醇溶液：將白藜蘆醇2.5 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 緩沖液避光過夜形成混合溶液，然后將上述溶液在冰浴條件下應用超聲勻漿機進行超聲處理，形成白藜蘆醇溶液(2.5 mg/ml)。超聲條件：持續(xù)超聲5 s，停2 s，連續(xù)循環(huán)45次，超聲探頭振幅13 μm。

白藜蘆醇脂質(zhì)體的性狀考察：采用透射電子顯微鏡考察載藥脂質(zhì)體表觀形態(tài)，應用動態(tài)光衍射法測定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布。

包封率是評價載體性質(zhì)的重要指標。包封率測定方法簡述如下：將上述制備載藥脂質(zhì)體溶液放入透析袋(截留分子量12～14 kD)，室溫透析2 h，除去未包封藥物及其他制備輔料。甲醇破壞脂質(zhì)體，應用HPLC測定載藥脂質(zhì)體中藥物含量。

載體包封率=載藥脂質(zhì)體中藥物含量/最開始加入藥物×100%

1.3.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將60只雄性健康SD大鼠(180～220 g)進行隨機分組：正常對照組15只(control)、糖尿病組15只(DM)、白藜蘆醇溶液組15只(1 ml/kg)、白藜蘆醇脂質(zhì)體組15只(1 ml/kg)。

1.3.3 糖尿病實驗動物模型建立及給藥方法 實驗動物進行隨機分組后維持飼養(yǎng)1周，1周后進行Ⅰ型糖尿病動物模型的建立。實驗組動物腹腔注射1%鏈脲佐菌素STZ (70 mg/kg)，對照組動物腹腔注射同劑量生理鹽水。于注射后第3、7、14天尾靜脈取血測定血糖。3次測定結果均>16.7 mmol/L且實驗動物明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿以及體重下降等現(xiàn)象即說明造模成功。此后白藜蘆醇干預組動物尾靜脈給藥白藜蘆醇脂質(zhì)體或白藜蘆醇溶液(1 ml/kg)，每周2次持續(xù)給藥12周。糖尿病組、正常對照組動物每周給予同劑量生理鹽水。12周后處死大鼠取材，剩余心肌細胞-80 ℃保存。

1.3.4 透射電鏡檢查 取各組大鼠左心室組織標本(1 mm3)，經(jīng)新鮮配置的多聚甲醛+戊二醛4 ℃ 前固定1 h，PBS反復洗滌，鋨酸后固定2 h；梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，LKB-1型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡JEM-1230(JEOL，Tokyo，Japan)下觀察拍照。

1.3.5 心肌細胞TUNEL染色 按照羅氏TUNEL凋亡試劑盒說明書，將組織切片脫蠟、酒精梯度浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反應液，蓋膜，37 ℃孵育60 min，PBS緩沖液沖洗3次，DAB室溫顯色10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，酒精梯度脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠3張切片，每個切片隨機計數(shù)無重疊具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細胞核中含凋亡細胞的數(shù)量作為心肌細胞凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)。

1.3.6 Western blot技術檢測 將組織從-80 ℃冰箱中取出，在裂解緩沖液中勻漿，4 ℃離心，取上清，高速離心，沉淀用1 ml Triton X-100緩沖液溶解，BCA試劑盒測定蛋白濃度備用。

每組按20 μg蛋白的溶液體積上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設為90 V，根據(jù)Maker移動情況適時終止電泳。進行轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入1∶5 000 稀釋的AKT及PAKT一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加二抗室溫孵育1 h。以β-actin為參照，DAB顯色后應用凝膠成像分析儀分析。

2 結果

2.1 白藜蘆醇載藥脂質(zhì)體的質(zhì)量表征 脂質(zhì)體透射電鏡觀察結果顯示，空白、載藥脂質(zhì)體均呈現(xiàn)標準的橢球型，且表面光滑無黏連、粒徑約100 nm，載藥前后無明顯變化。動態(tài)光衍射法測定載體粒徑及Zeta電位結果顯示，空白、載藥納米脂質(zhì)體的平均粒徑分別為(95.43±2.1)nm、(101.34±3.2) nm。多分散系數(shù)PI值分別為0.103、0.110(均<0.2)。同時，Zeta電位測定結果顯示，空白、載藥納米脂質(zhì)體分別為(-25.3±1.8)、(20.6±1.6) mV。包封率測定結果顯示，載藥納米脂質(zhì)體的包封率為90.76%±2.13%。見圖1。

2.2 大鼠心肌透射電鏡檢查結果 各實驗組大鼠心肌組織透射電鏡檢查結果見圖2，與正常對照大鼠比較，未經(jīng)任何形式干預的糖尿病組大鼠的心肌肌絲、肌原纖維的Z線(Z-line)都出現(xiàn)了嚴重的溶解、破壞，心肌細胞的線粒體出現(xiàn)明顯的空泡化。經(jīng)過白藜蘆醇溶液干預后，糖尿病大鼠心肌細胞仍存在明顯損傷，接近糖尿病大鼠，而白藜蘆醇脂質(zhì)體干預后，大鼠的心肌細胞肌絲、Z線完整，線粒體結構飽滿，心肌細胞超微結構基本接近正常對照組。

圖1 透射電鏡觀察空白及載藥納米脂質(zhì)體

2.3 心肌細胞的TUNEL凋亡染色結果 正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色，箭頭所示為凋亡心肌細胞的細胞核。與正常對照組大鼠比較，未經(jīng)任何形式干預的糖尿病組動物及經(jīng)過白藜蘆醇溶液干預的大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預組比較，經(jīng)過白藜蘆醇脂質(zhì)體干預組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)，接近正常對照組水平。見圖3。

2.4 心肌組織Western blot分析結果 各組實驗大鼠心肌PAKT、AKT蛋白Western blot檢查結果如圖4所示。與正常對照組比較，未經(jīng)任何藥物干預的糖尿病組大鼠及經(jīng)過白藜蘆醇溶液組干預大鼠心肌PAKT/AKT含量顯著下降(P<0.01)。與糖尿病組大鼠及白藜蘆醇溶液組比較，經(jīng)過白藜蘆醇脂質(zhì)體治療干預的大鼠心肌PAKT/AKT含量升高(P<0.05)，接近正常大鼠水平。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠的心肌超微結構(n=15)

圖3 各實驗組大鼠TUNEL凋亡染色結果(n=15)

圖4 Western blot 檢測各組大鼠心肌PAKT及AKT的表達(n=15)

注：1.正常對照組，2.糖尿病組，3.白藜蘆醇溶液組，4.白藜蘆醇脂質(zhì)體組。與正常對照組、白藜蘆醇溶液組比較，*P<0.01

3 討論

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌細胞原發(fā)性損傷引起的一種嚴重的并發(fā)癥，其致病因子復雜，病理特征多樣，主要包括心肌細胞肥大、凋亡及纖維化、心功能障礙等[12-13]，最終導致患者死亡，目前沒有有效的防治方法。已有研究證實，DCM導致的心肌細胞凋亡可以引起糖尿病患者心臟收縮、舒張單元減少，造成心臟重構，最終導致左心室功能紊亂[14]。因此，降低糖尿病患者的心肌細胞凋亡水平有望提高患者的心功能，實現(xiàn)DCM的防治功能。

白藜蘆醇是一類非黃酮類多酚化合物，具有清除自由基、抗氧化[15]，減少高糖誘導的心肌細胞氧化損傷等作用[16-17]。但是由于白藜蘆醇存在穩(wěn)定性差、溶解度低等問題，限制了其在體應用。本次研究在前期研究基礎上應用新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇，在體考察其對于糖尿病心肌病引起的心肌細胞凋亡的預防作用及其機制。

透射電鏡觀察結果證實，本次實驗制備的載藥納米脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑在100 nm左右，無黏連，且載藥、空白脂質(zhì)體的多分散指數(shù)均<0.2，說明載體粒徑分布均勻；另外，載體的Zeta電位測定結果顯示，載藥及空白脂質(zhì)體的Zeta絕對值均>15 mV，說明載藥、空白脂質(zhì)體穩(wěn)定性好；包封率測定結果也顯示，載藥脂質(zhì)體對于白藜蘆醇的包封率高達90.76%±2.13%，說明本次研究制備的脂質(zhì)體能夠較好地實現(xiàn)對于難溶性藥物白藜蘆醇的包載，提高其溶解度及穩(wěn)定性。

未經(jīng)任何形式藥物干預的糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預組大鼠12周后心肌細胞超微結構破壞嚴重，線粒體呈明顯的空泡化，心肌肌纖維及Z線斷裂、溶解。而經(jīng)過白藜蘆醇脂質(zhì)體干預后，大鼠心肌細胞超微結構明顯好轉(zhuǎn)，空泡化的線粒體數(shù)量明顯減少，心肌肌纖維及Z線清晰，連貫，心肌細胞超微結構接近正常對照組細胞，說明白藜蘆醇脂質(zhì)體干預能夠有效保護心肌細胞的超微結構，減少因為高糖引起的心肌細胞損傷。同時TUNEL凋亡染色結果也證實，與正常對照組比較，未經(jīng)任何形式藥物干預的糖尿病組及白藜蘆醇溶液干預組大鼠12周后，心肌細胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)，而經(jīng)過白藜蘆醇脂質(zhì)體干預后，大鼠的心肌細胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.01)，說明白藜蘆醇脂質(zhì)體能夠有效預防糖尿病心肌病引起的心肌細胞凋亡。

為了研究白藜蘆醇對于預防糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的作用機制，本研究應用Western blot分析各實驗組大鼠心肌細胞AKT、PAKT蛋白含量。AKT作為凋亡相關通路PI3K/AKT的下游蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT影響細胞的多種功能，包括細胞的生長、增殖、新陳代謝等。已有研究證實，作為AKT的一種活化形式，PAKT(磷酸化的AKT)能夠顯著降低缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡[18]。同時，PAKT蛋白的表達下降與心力衰竭、心功能障礙密切相關[19]。本研究證實，與正常對照組比較，未經(jīng)任何藥物干預及經(jīng)過單純白藜蘆醇溶液干預的糖尿病大鼠心肌細胞PAKT/AKT比值降低(P<0.05)，而經(jīng)過白藜蘆醇脂質(zhì)體干預后，PAKT/AKT的比值升高(P<0.05)，說明白藜蘆醇脂質(zhì)體能夠激活AKT蛋白，通過PI3K/AKT途徑調(diào)控糖尿病心肌病引起的心肌細胞損傷。

綜上所述，應用新型納米脂質(zhì)體包載白藜蘆醇后，能夠激活PI3K/AKT信號通道，實現(xiàn)對于糖尿病心肌病致心肌細胞凋亡的預防作用，為臨床糖尿病心肌病患者的防治提供了一種新的思路。而單純的白藜蘆醇溶液沒有顯著效果，大鼠應用白藜蘆醇溶液后，其內(nèi)環(huán)境的影響改變了白藜蘆醇溶液組成，使得白藜蘆醇在體內(nèi)重新析出成為難溶性物質(zhì)，從而無法發(fā)揮應有的效果，有待后續(xù)試驗進行相關研究。