圈養(yǎng)華南虎糞便細菌總DNA提取方法比較

李龍顯 ，陳茂金 ，林敏 ，曹玲霞 ，李雅婷 ，鄧賢才 ，鄔向東

（1.江西農(nóng)業(yè)大學動科院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)院）

華南虎是中國的十大瀕危動物之一、國家一級保護動物，紅色物種名錄極度瀕危，在野外已滅絕。目前南昌市動物園飼養(yǎng)著20多只華南虎，為了解圈養(yǎng)華南虎腸道細菌與腹瀉的相關(guān)性，本研究擬對南昌市動物園圈養(yǎng)的華南虎新鮮糞便進行細菌總DNA提取，然后進行微生物多樣性分析，以了解正常與腹瀉時糞便中細菌群落的變化規(guī)律，為防治華南虎腹瀉提供一定的科學依據(jù)。

高質(zhì)量的總DNA的提取是通過高通量測序研究腸道微生物的前提，直接關(guān)系到后續(xù)實驗的可行性和準確性。糞便組成復(fù)雜，不同食性動物糞便組成又有所區(qū)別，從而使得提取糞便微生物總DNA的方法通用性較差。因此，找到一種適合本實驗研究的糞便樣品微生物總DNA提取方法尤為重要。本文選取了常用的6種提取方法和2種提取策略組合成新的方法，分別提取肉食性動物糞便總DNA，對比其提取效果，找出最適合的提取方法，為進一步研究圈養(yǎng)華南虎腸道微生物提供適合的研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及配制。100bp DNA Lodder、Taq×2 PCR mix、λDNA/HindⅢ （北京全式金公司）；Tris 平衡酚、CTAB、溶菌酶、蛋白酶、RNase A、糞便基因組DNA提取試劑盒（北京索來寶生物科技公司）；瓊脂糖（西班牙BIOWEST）；氯仿、異戊醇（國產(chǎn)分析純）。

裂 解 液 Ⅰ ：1.17%NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)、1%SDS、1.86%EDTA Na2、1%Triton X-100，滅菌存放。

裂 解 液 Ⅱ ：0.25 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.01 mol/L EDTA（pH8.0）、0.05%SDS、0.029%NaCl，滅菌存放。

CTAB 溶液：0.4%CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl、0.01 mol/L EDTANa2、1.4 mol/L NaCl 、1%PVP K-30，調(diào)pH至7備用。

酚、氯仿、異戊醇配比：取50%體積酚、48%體積的氯仿、2%體積的異戊醇混合，避光保存。

1.1.2 主要設(shè)備。5415R冷凍高速臺式離心機（美國Eppendorf公司）；960型梯度PCR儀 （杭州晶格公司）；JY300C型電泳儀、JY02S型紫外分析儀 （上海君意東方公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅公司）。

1.1.3 相關(guān)引物。本研究采用細菌16S rDNA全長通用引物，預(yù)計擴增DNA片段長度大約為1500bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

引物名稱 引物序列（5'→3'） 16SrDNA上的位置27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 27-46 1429R GGTTACCTTGTTACGACTT 1410-1429

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。早晨8～9點氣溫較低時，用無菌凍存管從南昌動物園采集新鮮的華南虎糞便。用無菌燒杯稱取糞便2.4 g，加入12 mL PBS溶液震蕩攪拌均勻，分裝12支1.5mL離心管中。

1.2.2 糞便微生物總DNA提取

取6支糞便樣品直接提取DNA；另取6支糞便樣品經(jīng)預(yù)處理后再提取DNA，預(yù)處理方法見1.2.2.1。

1.2.2.1 樣品預(yù)處理。將糞便樣品震蕩混勻，4℃800 rpm離心5 min取上清；取沉淀加1 mL PBS重懸，相同條件重復(fù)離心1次；棄上清，4℃12 000 rpm離心5 min取沉淀，沉淀用PBS洗滌3次，4℃ 12 000 rpm離心5 min，留沉淀備用。

②大數(shù)據(jù)技術(shù)的運算工作基于強大的計算機處理系統(tǒng)，數(shù)據(jù)獲取和整合速度快，便捷性程度高，方便城鄉(xiāng)規(guī)劃人員與管理者進行設(shè)計與決策，且有助于資源的合理調(diào)配，可以在一定程度上減少城市規(guī)劃的經(jīng)費開支[1]。

1.2.2.2 總DNA提取方法。經(jīng)文獻查詢，共選擇了6種方法，分別是：

方法1（酶化學法Ⅰ）：分別取未處理樣品和預(yù)處理樣品各 1份，加入 200 μL TE，20 μL溶菌酶(100 mg/mL)，37℃處理 40 min，加入 500 μL 裂解液Ⅰ，10 μL 蛋白酶 K (20 mg/m L)，55℃水浴過夜；加入 2 μL RNase A，37℃消化 30 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min；取上清置1.5mL的離心管中，用苯酚、氯仿各抽取1次，取上清至離心管；加入50 μL 3 mol/L醋酸鈉和1000μL預(yù)冷無水酒精，-20℃靜置沉淀5h；4℃ 12 000rpm離心10 min，取沉淀加入500μL 70%的乙醇洗滌1次；去上清，干燥15 min，溶于 50 μL ddH2O 中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法2（CTAB法）：分別取未處理樣品和預(yù)處理樣品各1份，分別加入CTAB溶液500 μL和β-巰基乙醇2 μL，60℃水浴15min；取上清置1.5 mL離心管中；用酚和氯仿抽取2次；加1 000μL冰預(yù)的無水酒精沉淀20min；12 000rpm離心10 min，棄上清；加入預(yù)冷的500μL 70%酒精洗滌1次，沉淀于室溫晾干；加50 μL ddH2O溶解；并加入終濃度為 20μg/mL的 RNA 酶 A，37℃處理 30 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法3（SDS堿裂解法）：分別取未處理樣品和預(yù)處理樣品各1份，加入600 μL堿性裂解液Ⅱ，劇烈震蕩；放入55℃水浴60 min；室溫分別加入200 μL 3mol/L醋酸鈉，震蕩 20s，充分混勻 4℃ 12 000 rpm離心3 min；取上清加入等體積的苯酚、氯仿抽取2次；取上清加入600 μL異丙醇沉淀DNA，4℃12 000 rpm 離心 5 min；棄上清，加入 600 μL 70%乙醇溶液洗滌1次；棄上清，干燥15 min，加入50 μL ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法4（試劑盒法）：參照試劑盒說明書，分別取未處理樣品和預(yù)處理樣品各1份分別提取總DNA。

方法5（酶化學法Ⅱ）：分別取未處理樣品和預(yù)處理樣品各1份，分別加入100 mg/mL溶菌酶20 μL，37℃溫浴 45 min； 再加入 50μL 10%SDS 和15μL 10 mg/mL蛋白酶K，55℃水浴1h； 用酚∶氯仿∶異戊醇抽取1次；用氯仿∶異戊醇抽取一次，取上清加入50μL醋酸鈉和1 000 μL-20℃預(yù)冷無水酒精混勻，-20℃沉淀 5 h；4℃下 12 000 rpm離心 10 min，取沉淀加入500μL 70%的酒精洗滌1次；去上清液，沉淀干燥 15 min，溶于 50 μLddH2O，并加入終濃度為 20 μg/mL的 RNA 酶 A，37℃放置 30 mi，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上每個樣品處理均重復(fù)3次，下同。

1.2.3 目測總DNA溶液顏色及潔凈度。肉眼觀察6種方法提取糞便樣品的總DNA顏色及潔凈度，初步判斷總DNA質(zhì)量。

1.2.4 總DNA瓊脂糖凝膠電泳分析。取5μL提取的總DNA溶液， 再加入 1 μL 6×DNA Loading buffer上樣緩沖液混勻；并使用λDNA/HindⅢ作為maker，1μL ddH2O做模板的擴增產(chǎn)物作為陰性對照，1%瓊脂糖電泳35 min，電泳完畢后，將膠放入紫外分析儀內(nèi)觀察并拍照分析結(jié)果。

1.2.5 總DNA的得率和純度測定分析。加2 μL提取的糞便微生物總DNA樣品與Nanodrop 2 000微量紫外分光光度計上測定DNA濃度和OD260/OD280值。

1.2.6 總DNA PCR擴增分析。用6種方法分別提取糞便樣品總DNA作為模板，采用16SrDNA通用引物27F/1429R對整個16SrDNA基因進行PCR擴增，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。設(shè)立以ddH2O為擴增模板的陰性對照。

PCR擴增體系為：

2xPCR Mix 12.5 μL 27F 1.0 μL 1429R 1.0 μL DNA 1.0 μL ddH2O 9.5 μL Total 25.0 μL

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 40s，55℃退火50s，72℃延伸50 s，進行33個循環(huán)后；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物，并使用100bp DNA Ladder作為 Maker，1 μL ddH2O 做模板的擴增產(chǎn)物作為陰性對照，1%瓊脂糖凝膠電泳35 min，取凝膠于紫外分析儀內(nèi)觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 目測總DNA溶液顏色和潔凈度結(jié)果

6種方法分別提取2組糞便樣品，每種方法均重復(fù)3次。結(jié)果總DNA溶液顏色和潔凈度如下圖1所示?？梢娊?jīng)預(yù)處理過和未經(jīng)預(yù)處理物糞便樣品提取的總DNA溶液都成透明無色狀態(tài)，6種方法都能除去糞便內(nèi)的色素等物質(zhì)。

圖1 6種方法提取2組糞便樣品總DNA圖a～f分別為方法1、方法2、方法3、方法4、方法5、方法6；每幅圖從左到右1～3為預(yù)處理后提取DNA；4～6為直接提取DNA

2.2 糞便總DNA瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

6種不同方法提取2組不同組糞便的總DNA，每個樣品重復(fù)處理3次，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外分析儀下觀察，結(jié)果如圖2。

如圖可見，J1、Z1都有明顯的特異性條帶，條帶大小約為23 kb，說明方法1提取效果較好；J2、Z2沒有明顯特異性條帶且降解較為嚴重，說明方法2提取效果較差；J3沒有明顯的特異性條帶，Z3有明顯特異性條帶，說明方法3中，直接法比預(yù)處理法更理想。J4、Z4沒有特異性條帶，說明方法4提取的不理想；J5、Z5都有特異性條帶，而且亮度較大，但都伴隨有較嚴重的拖帶和降解，這說明方法5提取的DNA濃度較高，但有一定的碎片化；J6、Z6沒有明顯條帶，但降解嚴重，這可是是方法6煮沸過程中太過于激烈，導(dǎo)致大量DNA斷裂。綜上我們可知對于華南虎糞便DNA提取以方法1效果最好，方法5其次。

2.3 細菌16S rDNA全長基因擴增分析

用細菌16S rDNA全長通用引物27F/1429R對6種方法提取4組糞便細菌總DNA PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。

圖3 6種方法提取2組糞便總DNA 27F/1429R擴增產(chǎn)物電泳圖M：100bp DNA Ladder；CK：陰性對照；J1-J6 為 6 種方法對預(yù)處理后樣品總DNA PCR擴增產(chǎn)物；Z1～Z6為6種方法對未處理樣品直接提取DNA進行PCR擴增產(chǎn)物。

方法1、2、4、5都能擴增出特異性條帶，但方法1、2提取預(yù)處理糞便組的總DNA擴增條帶亮度比未處理糞便組總DNA擴增條帶高。方法3未處理糞便組重復(fù)性差，預(yù)處理糞便組有明顯特異性條帶。方法4、5不受樣品預(yù)提處理影響，都能擴增出較亮的條帶。方法6不論是預(yù)處理或不做預(yù)處理，提取重復(fù)性均不理想。

3 小結(jié)與討論

3.1 樣品采集和保存

隨著人類活動范圍越來越大，對野生動物和植物大量獵殺和采伐，導(dǎo)致野生動物數(shù)量越來越稀少。這使得野生動物樣本采集變尤為困難。特別是研究其腸道微生物群落結(jié)構(gòu)組成時，采集野生動物腸道樣本將損害動物健康。在此種情況下，無損傷性取樣方法被學者提出，如采集糞便、血液、毛發(fā)作為研究樣本。此后該方法多被廣泛運用野生動物研究。有研究表明，糞便樣品提取的總DNA質(zhì)量受采集樣品環(huán)境溫度和樣本保存方法的影響。環(huán)境溫度較低時采集樣品提取的總DNA質(zhì)量高于環(huán)境較溫時采集的樣本提取的總DNA質(zhì)量，而直接冷凍方法保存糞便樣品提取總DNA質(zhì)量高于其他方法保存樣品。

本實驗采用非損傷性的研究方法，在早上氣溫較低時到虎籠中采集樣品作為研究樣本，并迅速放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 糞便樣品總DNA提取質(zhì)量比較

有研究表明，糞便樣品提取的總DNA質(zhì)量受動物食性和提取方法的影響，并且在提取前適當?shù)念A(yù)處理能減少提取的總DNA中的PCR抑制物存在。因此一種合適的糞便總DNA提取方法就顯得尤為重要。

本實驗選取了6種常用的糞便DNA提取方法，采用適當預(yù)處理和不進行預(yù)處理的兩組樣品。比較6種方法和2種提取策略組合方法中對華南虎最優(yōu)組合方法。

研究結(jié)果顯示方法1直接提取糞便效果最好，提取的總DNA純度高，片段完整度高和生物多樣性好。對微生物16S rDNA擴增效果來看，方法1、2經(jīng)預(yù)處理樣品擴增效果和方法4、5的PCR擴增效果是最好的，方法1、2未處理糞便樣品效果次之，其他方法不太理想。根據(jù)提取效果，我們將采用方法1直接提取總DNA，擴增16SrDNA進行一步研究。