祛脂調(diào)肝中藥對(duì)非酒精性脂肪肝SD大鼠瘦素和腫瘤壞死因子-α的影響

欒 梅 邱雅慧 欒 博 趙麗娟 霍博雅 張龍昌

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是無顯著酒精攝入、嗜肝病毒感染，或其他特殊原因的肝臟疾病而出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪蓄積為特征的肝病綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并無確切的病名與之相對(duì)應(yīng)，歸屬于“脅痛”、“癥瘕”、“積聚”、“痰濁”“濕氣”等范疇〔1〕，中醫(yī)中藥在治療NAFLD有優(yōu)勢，本研究探討祛脂對(duì)NAFLD大鼠肝臟組織瘦素、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料 動(dòng)物：健康SD大鼠50只，雄性，6～8周齡，體重(250±20)g。由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼料：高脂飼料：豬油10%，膽酸鈉0.5%，膽固醇2%，丙硫氧嘧啶0.2%，基礎(chǔ)飼料82.8%。

1.2藥物 祛脂調(diào)肝組藥：制首烏、金櫻子、決明子、生薏仁、生山楂各30 g，茵陳、澤瀉各20 g，柴胡、郁金各12 g，五味子、靈芝各15 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬三醫(yī)院制劑中心制備成濃度為9.15 mg/ml的煎劑；水飛薊素，盤錦森榮制藥有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H21023075。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 隨機(jī)將50只SD大鼠分5組，每組10只，分別為正常組、模型組、祛脂調(diào)肝高、低劑量組、水飛薊素組。實(shí)驗(yàn)開始前4組動(dòng)物分別稱重，喂養(yǎng)條件如下：先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)所有大鼠1 w，除正常組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余4組再用高脂飼料分別對(duì)模型組、祛脂調(diào)肝高、低劑量組，水飛薊素組實(shí)驗(yàn)性灌胃4 w后開始正式試驗(yàn)，動(dòng)物試驗(yàn)于造模成功后，祛脂調(diào)肝高、低劑量組每日清晨分別給予38.8、19.6 g/kg灌胃，水飛薊素組于造模同期每日給予水飛薊素水溶液(20 g/kg)灌胃4 w。

1.3.2實(shí)驗(yàn)取材及標(biāo)本收集 除正常組外動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第9周末(處死前12 h禁食)稱重，以水合氯醛腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血10 ml，分離血清，然后打開腹腔，迅速取肝組織，肝臟稱重后浸泡4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，制作蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。冰盤上剪取一小塊肝葉，剪碎，移入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷的生理鹽水，研磨制備10%肝組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測肝組織勻漿瘦素、TNF-α的表達(dá)。

1.3.3檢測項(xiàng)目及方法 于處死后立即取出肝臟，計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)(%)=肝濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。血清學(xué)指標(biāo)檢測游離脂肪酸(FFA)，三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3.4肝臟病理組織學(xué)觀察 取新鮮肝葉相同部位組織，以4%甲醛溶液充分固定，經(jīng)各級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察肝組織病理學(xué)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠肝指數(shù)、血脂水平比較 與正常組比較，模型組肝脂數(shù)明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，祛脂調(diào)肝低劑量組及水飛薊素組肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與正常組比較，模型組TG、TC、LDL-C、FFA明顯增高，HDL-C的水平明顯下降(P<0.05)，與祛脂調(diào)肝高、低劑量組、水飛薊素組比較，模型組TG、TC、LDL-C、FFA水平明顯下降，HDL-C水平明顯升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組肝脂數(shù)、血脂水平比較

與正常組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

2.2各組肝組織瘦素、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組、祛脂調(diào)肝高、低劑量組、水飛薊素組肝臟組織中瘦素、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，祛脂調(diào)肝高、低劑量組、水飛薊素組肝臟組織中瘦素和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3大鼠肝組織病理檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組肝細(xì)胞充滿脂肪空泡，空泡大小不一，與模型組比較，祛脂調(diào)肝高、低劑量組、水飛薊素組肝細(xì)胞脂肪空泡明顯減少，祛脂調(diào)肝高劑量組與低劑量組、水飛薊素組比較肝細(xì)胞的脂肪空泡數(shù)最少，見圖1。

表2 各組肝臟組織瘦素和TNF-α水平比較

圖1 各組肝臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，中醫(yī)藥在脂肪肝治療中取得可喜效果，11味祛脂調(diào)肝組的柴胡、五味子、靈芝、生山楂有保肝作用；五味子可以促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)；生山楂、決明子、澤瀉有降血脂、抗脂肪肝及保肝的作用。水飛薊素具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、降血脂、清除氧自由及免疫調(diào)節(jié)的作用〔2～6〕。本研究顯示袪脂調(diào)肝藥有糾正脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪因子瘦素參與調(diào)節(jié)肝臟脂代謝，并與NAFLD的發(fā)生有密切關(guān)系〔7〕。瘦素是由Ob基因編碼，脂肪組織分泌的肽類激素，主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝穩(wěn)定。正常生理?xiàng)l件下體內(nèi)瘦素與胰島素之間有雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，胰島素可增加脂肪瘦素的表達(dá)，增加血漿的瘦素濃度。另一方面，瘦素通過增加ATP依賴性K離子通道開放來抑制胰島素的分泌。在病理狀態(tài)下，體內(nèi)胰島素對(duì)瘦素的敏感性下降，由于瘦素和胰島素之間相互作用，出現(xiàn)高瘦素、高胰島素水平。高瘦素水平通過胰島素抵抗，產(chǎn)生與胰島素相關(guān)的肝內(nèi)脂肪貯積，增加肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸，使之轉(zhuǎn)變?yōu)門G，引起脂肪肝〔8〕。TNF-α主要由肝巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是介導(dǎo)肝損傷的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生的首選因子，通過不同方式參與脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)，它可通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝細(xì)胞胰島素受體底物(IRS)-1和-2的磷酸化，導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素抵抗形成〔9〕。分泌型TNF-α和膜型TNF-α是其兩種形式結(jié)構(gòu)，前者可以活化神經(jīng)鞘磷脂酸，抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞，使線粒體活性氧(ROS)升高，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死〔10～14〕，此外，TNF-α還可誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體UCP-2基因表達(dá)，進(jìn)而抑制線粒體內(nèi)ATP的生成，導(dǎo)致細(xì)胞壞死〔11〕。并能與細(xì)胞PPAR-α結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧形成，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明祛脂調(diào)肝藥通過減少肝臟中FFA的堆積，降低血清TNF-α水平提高胰島素敏感性，保護(hù)肝細(xì)胞。