吉林省北五味子種子種苗帶菌檢驗(yàn)初步研究

崔麗麗，閆梅霞，馮志偉，金銀萍，許陪磊，王英平※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.撫松縣參王植保有限責(zé)任公司，吉林 撫松 134504）

種子的質(zhì)量由種子的純度、活力、健康狀況等因素決定。種子品質(zhì)是提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。種傳病原菌可以導(dǎo)致種子不育、種子萎縮變小、變色、腐爛壞死和萌發(fā)力降低[1]。為保證種子質(zhì)量，對(duì)種子進(jìn)行健康檢驗(yàn)尤為重要。五味子〔Schisandra chinensis(Turcz.)Baill〕為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本藥用植物，以果實(shí)入藥。五味子屬（SchisandraMichx）全世界約有50種，主要分布在東亞地區(qū)，在我國(guó)約有20種，分布于西南、華南至東北地區(qū)。產(chǎn)于東北三省及內(nèi)蒙古的習(xí)稱(chēng)北五味子（又稱(chēng)遼五味子），產(chǎn)于南方的習(xí)稱(chēng)南五味子，產(chǎn)于西北地區(qū)的習(xí)稱(chēng)西五味子[2]。五味子藥、食兼用，具有較高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。五味子在中醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥。目前，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道的五味子真菌病害種類(lèi)為黑斑病〔鵝掌揪鏈格孢（Alternaria liriodendri T.Y Zhang et J.Z.Zhang）〕[3,4]、根腐病〔尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）〕[3]、莖基腐病〔木賊鐮刀菌（F.equiseti）、茄腐鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）〕[5]、葉枯?。奂?xì)極鏈格孢〔A.tenuissima（Fr.）Wiltshire〕］[6,7]、褐斑病［球狀莖點(diǎn)霉〔Phoma glomerata（corad）Wollena ex Hoehapf〕］[8]、白粉病〔五味子叉絲殼菌（Microsphaera schizandrae）〕[9,10]、立枯病（Rhizoctonia solani）[11]、銹病〔五味子春孢銹菌（Aecidiumschisandrae）〕[12]。北五味子是長(zhǎng)白山地區(qū)特色的植物資源，近年來(lái)，人工栽培面積在不斷增加，五味子病蟲(chóng)害也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，病蟲(chóng)害防治是北五味子栽培的重要技術(shù)環(huán)節(jié)[13]。目前，有遼寧省北五味子種子、種苗帶菌檢測(cè)研究的報(bào)道[14,15]。本試驗(yàn)以吉林省北五味子種子、種苗為對(duì)象進(jìn)行健康檢測(cè)，為種子、種苗標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論依據(jù)，同時(shí)為病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年10月初分別收集于吉林省撫松縣和吉林省昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)。種子樣品8份（吉林省撫松縣5份，吉林省昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)3份），每份約200?！?00粒；種苗樣品10份（撫松縣5份，左家鎮(zhèn)5份），每份20株～30株。

1.2 供試材料處理

1.2.1 種子處理 每1份樣品隨機(jī)選取100粒種子，在無(wú)菌操作臺(tái)中，50粒種子 3%NaClO無(wú)菌消毒3min～4min，無(wú)菌水沖洗3次；另外50粒種子3%NaClO消毒4min，無(wú)菌水沖洗3次，分開(kāi)種殼和種仁，晾干待用。外部帶菌檢測(cè)隨機(jī)取樣50?！?00粒種子，無(wú)處理，待測(cè)。

1.2.2 種苗處理 取1cm～2cm長(zhǎng)莖，3%NaClO消毒3min～4min，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌手術(shù)刀平分為5段，每份樣品處理10株，晾干待用。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板法 種子內(nèi)部帶菌檢測(cè)：培養(yǎng)皿（直徑9cm）中倒入10mL已滅菌 PDA制成平板。種子檢測(cè)時(shí)將已處理好的10個(gè)整粒種子、10個(gè)種殼、10個(gè)種仁分別放入3個(gè)培養(yǎng)皿中；種苗檢測(cè)時(shí)每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻地放入已處理好的5段莖，1株種苗1個(gè)培養(yǎng)皿，25℃、光照和黑暗各12 h交替培養(yǎng)（培養(yǎng)皿應(yīng)在燈下約25cm處，不堆疊放置）7d～10d。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不放種子的空白對(duì)照，3次重復(fù)。

種子外部帶菌檢測(cè)：不消毒直接培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置方法和數(shù)量與內(nèi)部帶菌檢測(cè)一致。

肉眼觀察菌落形態(tài)，立體顯微鏡20×觀察真菌生長(zhǎng)情況，100×觀察辨認(rèn)分生孢子，記錄每平板中感染種子數(shù)，同時(shí)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PDA分離純化培養(yǎng)，獲得純菌株后PDA試管保存。

1.3.2 紙培養(yǎng)法 每個(gè)培養(yǎng)皿中放入2張滅菌濾紙，加入無(wú)菌水約10mL備用。檢測(cè)方法同PDA平板法。

1.4 真菌鑒定

PDA平板法和紙培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)將分離到的真菌分別進(jìn)行純化、鏡檢和轉(zhuǎn)管保存。根據(jù)培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子帶菌檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 種子外部帶菌結(jié)果 種子外部帶菌率 PDA培養(yǎng)法（32.11%～46.07%）稍高于紙培養(yǎng)法（22.47%～45.38%），種子外部攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群主要為青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）、根霉屬（Rhizopus sp.），分離頻率分別為43.90%～75.07%、2.44%～21.2%、2.44%～10.15%。此外，還有鐮刀菌屬（Fusariumspp.）、鏈格孢屬（Alternaria spp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）和毛霉屬（Mucorsp.）。對(duì)比不同地區(qū)，撫松縣種子外部帶菌率比左家鎮(zhèn)低13%左右。見(jiàn)表1。

2.2 北五味子種苗帶菌檢測(cè)結(jié)果

表1 北五味子種子外部分離真菌及分離頻率Table 1 Genera and proportions of fungi isolated from S.chinensis seed suface

2.1.2 種子內(nèi)部帶菌結(jié)果 種子內(nèi)部分離頻率最高的是青霉屬，分離頻率為25.00%～71.42%。檢驗(yàn)方法不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異。與紙培養(yǎng)法相比，PDA法檢測(cè)出的真菌種類(lèi)多，共檢出青霉屬、鐮刀菌屬、鏈格孢屬、木霉屬、葡萄孢屬（Botrytisspp.）、毛霉屬和曲霉屬8種，紙培養(yǎng)法沒(méi)有檢測(cè)到葡萄孢屬和毛霉屬。

種子內(nèi)部帶菌率在地區(qū)間有差異，整粒種子、種殼和種仁的帶菌率撫松縣均較高，整粒種子為11.15%～12.50%、種 殼 為 9.38%～9.56%、種 仁 為8.16%～15.00%；左家鎮(zhèn)樣品整粒種子為7.87%～9.09%、種殼為6.09%～9.38%、種仁為6.56%～7.30%。

表2 北五味子種子內(nèi)部真菌及分離頻率Table 2 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seed

采用 PDA平板法檢測(cè)的種苗帶菌率為53.33%～76.11%，明顯高于紙培養(yǎng)法（13.67%～20.19%），檢出真菌主要有鏈格孢屬（帶菌率37.28%～60.22%）、鐮刀菌屬（帶菌率7.12%～22.35%）、木霉屬（帶菌率3.76%～14.24%），其次，還有毛殼菌屬（Chaetomium spp.）、柱孢屬（Cylindrocarpom spp.）、彎孢屬（Curvularia spp.）、曲霉屬、青霉屬。PDA平板法檢測(cè)出了紙培養(yǎng)法沒(méi)有檢出的彎孢屬。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論與討論

表3 北五味子種苗真菌及分離頻率Table 3 Genera and frequenceies of fungi isolated from inside seedling

3.1 對(duì)來(lái)自撫松縣、左家鎮(zhèn)的8份北五味子種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北五味子種子外部帶菌率為22.47%～46.07%，明顯高于內(nèi)部帶菌率（4.69%～12.50%），但是種子內(nèi)部攜帶真菌種類(lèi)多。

3.2 對(duì)來(lái)自撫松縣和左家鎮(zhèn)兩個(gè)地區(qū)10份種苗資源進(jìn)行帶菌檢測(cè)，種苗帶菌率明顯高于種子帶菌率，其中，鏈格孢屬分離頻率最高，其次是鐮刀菌屬。

3.3 五味子種苗攜帶柱孢屬真菌為首次報(bào)道，但尚未有柱孢屬真菌引起五味子病害的報(bào)道。柱孢屬真菌是一種常見(jiàn)的土壤習(xí)居菌，地理分布較廣，英國(guó)、美國(guó)、法國(guó)、中國(guó)、日本、韓國(guó)等很多國(guó)家均有柱孢屬真菌報(bào)道，柱孢屬真菌寄主范圍也很廣，分別隸屬于61科108屬，果苗、花卉及以根入藥的植物上其危害較大[17]。中國(guó)人參銹腐病4類(lèi)致病銹腐菌為柱孢屬真菌，年平均發(fā)病率在20%～30%左右，在主要參區(qū)則高達(dá)70%～80%，嚴(yán)重影響了人參的質(zhì)量和產(chǎn)量。K.A.Seifert等[18]用微管蛋白基因和rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列方法測(cè)定北美西洋參根腐病菌株確定為Cylindrocarpon destructans。Traquair等[19]報(bào)道，C.destructans導(dǎo)致果蔬儲(chǔ)藏期的發(fā)霉和果樹(shù)冷藏期的腐爛，可見(jiàn)，柱孢屬真菌的危害很大。本試驗(yàn)分離到柱孢屬菌株，還需要對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性和致病性等相關(guān)其他研究。

3.4 不同檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，與紙培養(yǎng)法相比，PDA法檢測(cè)出的真菌種類(lèi)多，更能反映出真實(shí)的種子、種苗帶菌情況。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)吉林省2個(gè)產(chǎn)地北五味子種子、種苗攜帶的真菌種類(lèi)及帶菌率進(jìn)行了初步研究，而關(guān)于五味子種子、種苗健康檢驗(yàn)工作還需要進(jìn)一步開(kāi)展。