黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠炎性因子及凋亡相關(guān)蛋白的影響

潘宋斌，萬琳，邵衛(wèi)，唐坤，姚漢云

1.武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北武漢市430022；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢市430014

目的 探討黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠炎性因子及凋亡相關(guān)蛋白的影響。

方法 SPF級Sprague-Dawley健康雄性大鼠40只隨機分為假手術(shù)組、模型組和黃角顆粒組，每組10只，余10只備用。采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血2 h再灌注模型，其中假手術(shù)組和模型組在假手術(shù)前或缺血再灌注前30 min予生理鹽水10 ml/kg灌胃，黃角顆粒組在缺血再灌注前30 min予黃角顆粒溶液10 ml/kg(生藥含量1 g/ml)灌胃。再灌注24 h后，Longa評分法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，TTC染色檢測各組腦梗死體積百分比，HE染色觀察各組腦組織病理形態(tài)，TUNEL檢測各組腦細(xì)胞凋亡，ELISA檢測各組血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量，Western blotting檢測各組大鼠腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。

結(jié)果 與模型組相比，黃角顆粒組神經(jīng)功能評分顯著降低(P＜0.001)，腦梗死體積百分比和腦細(xì)胞凋亡率降低(P＜0.05)；血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平降低(P＜0.05)；腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和Bax的表達(dá)均降低(P＜0.05)，Bcl-2的表達(dá)升高(P＜0.05)。

結(jié)論 黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用與抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡相關(guān)。

腦血管病、惡性腫瘤和心臟病是目前世界上三大最主要的致死疾病。隨著腦血管病發(fā)病率的升高，其較高的致殘率和死亡率，給人們的身體健康和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[1]。在各類腦血管病中，缺血性腦血管病的發(fā)病率最高。腦缺血是指由多種原因所導(dǎo)致的腦動脈供血障礙，從而引發(fā)機體產(chǎn)生一系列病理生理變化的一類疾病[2-3]?？焖僭俟嘧⑹侨毖阅X血管病的重要治療策略，但是腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)是大多數(shù)缺血性腦血管病的主要病理生理機制，指腦部血供中斷后，重新開通閉塞血管及恢復(fù)大腦血供后會進(jìn)一步造成腦組織損傷，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與其具有密切聯(lián)系[4-6]。研究表明，腦缺血再灌注后，可激活機體免疫系統(tǒng)，白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎性細(xì)胞因子分泌增多，引起神經(jīng)元損傷以及增加其凋亡，因此，抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡對于減輕腦缺血再灌注損傷具有重要作用[7-8]。

黃角顆粒由大黃和水牛角兩味中藥組成，具有通腑泄熱、涼血解毒的功效。已有研究證實其對于腦梗死和急性腦缺血的治療作用顯著[9-10]。本研究采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷后炎性因子及凋亡相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

SPF級Sprague-Dawley健康雄性大鼠40只，體質(zhì)量(230±20)g，8～9周齡，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動物許可證號SCXK(鄂)2015-0018。所有大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料在12 h明暗交替環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫25℃，自由飲水。實驗過程中大鼠處置嚴(yán)格遵守動物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

黃角顆粒(大黃和水牛角按1∶2比例配置)：武漢市第一醫(yī)院制劑科。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測試劑盒：武漢博士德公司。氯化三苯四唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)溶液：美國SIGMA公司。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號RA20020)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號RA20607)和TNF-α ELISA試劑盒(貨號RA20035)：武漢BIO-SWAMP公司。兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶3剪切(cleaved-caspase 3)(貨號ab2302，稀釋比1∶200)、兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶9剪切(cleaved-caspase 9)(貨號ab2324，稀釋比1∶200)、兔抗人單克隆抗體B淋巴細(xì)胞瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)(貨號ab32124，稀釋比1∶1000)、兔抗人單克隆抗體Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)(貨號ab32503，稀釋比1∶1000)、兔抗人多克隆抗體 β 肌動蛋白(β-actin)(貨號 ab8227，稀釋比 1∶2000)和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(貨號ab6721，稀釋比1∶2000)：英國ABCAM公司。

高速離心機：德國EPPENDORF公司。電泳儀：美國BIO-RAD公司。石蠟包埋機和石蠟連續(xù)切片機：德國LEICA公司。攤片烤片機：湖北康強醫(yī)療器械有限公司。光學(xué)顯微鏡及顯微鏡成像分析系統(tǒng)：日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗分組

先將40只大鼠依次編號1～40號，計算機生成隨機數(shù)字表，任意選擇表中一個數(shù)為起始點對應(yīng)大鼠編號1，從左至右、從上至下分別對應(yīng)1～40號大鼠，用抽取的數(shù)字除以3，余數(shù)0、1、2分別對應(yīng)假手術(shù)組、模型組和黃角顆粒組，每組10只大鼠，剩余10只大鼠備用。

1.3 造模

參考Longa法建立大鼠左側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[11-12]。大鼠術(shù)前禁食24 h，自由飲水，10%水合氯醛3.5 ml/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)備皮進(jìn)行常規(guī)消毒，取頸部正中縱切口，長約2 cm，暴露左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支甲狀腺上動脈和枕動脈、頸內(nèi)動脈及其分支翼腭動脈，特制尼龍線栓自頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，遇輕微阻力即停止推進(jìn)，此時線栓插入深度約20 mm，即可阻斷大腦中動脈，引起左側(cè)MCAO。缺血2 h后，將尼龍線栓抽出，恢復(fù)左側(cè)大腦中動脈供血。將麻醉蘇醒后的大鼠放回鼠籠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，讓其自由飲食。術(shù)中需保持室內(nèi)溫度為25℃。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組大鼠僅切開頸部皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈。模型組和黃角顆粒組參考Longa法建立MCAO模型。其中假手術(shù)組和模型組在假手術(shù)前或缺血再灌注前30 min予生理鹽水10 ml/kg灌胃，黃角顆粒組在缺血再灌注前30 min予黃角顆粒溶液10 ml/kg(生藥含量 1 g/ml)灌胃[9-10]。

1.5 神經(jīng)功能評分

各組缺血再灌注24 h后參考經(jīng)典的MACO模型神經(jīng)功能評分(Longa評分法)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀。1分：不能完全伸展對側(cè)前爪。2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：向?qū)?cè)傾斜。4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

要實現(xiàn)基礎(chǔ)地理信息數(shù)據(jù)與地理國情要素數(shù)據(jù)的有機整合，其核心問題就是生產(chǎn)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)規(guī)定編制。即結(jié)合基礎(chǔ)地理信息數(shù)據(jù)和地理國情要素數(shù)據(jù)的特征，制定兼容二者的要素代碼規(guī)則、要素內(nèi)容和指標(biāo)，同時也要滿足各類成果數(shù)據(jù)自動抽取的要求。

1.6 TTC檢測

各組大鼠缺血再灌注24 h后，在冰盤上快速斷頭處死大鼠取腦，將其置于-80℃冰箱中冷凍3～5 min后，自額極向后冠狀面切成2 mm厚的切片。將切片浸泡在37℃的1%TTC溶液中在避光條件下溫浴30 min，期間每隔5 min翻動一下切片，染色成功后，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。用數(shù)碼相機拍照，應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行處理，分析并計算大鼠腦梗死體積百分比。

1.7 HE染色

各組缺血再灌注24 h后快速斷頭處死大鼠取腦組織，10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，制成石蠟切片。冠狀切片，片厚4 μm，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.8 TUNEL檢測

將制好的石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色，檢測各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，方法步驟按照TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片經(jīng)60℃烤片、二甲苯透明、梯度酒精水化后蛋白酶K于37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)漂洗3次后加入TUNEL反應(yīng)液50 μl，將玻片置于濕盒中，37℃避光孵育60 min，PBS漂洗后滴加過氧化物酶(peroxisome,POD)反應(yīng)液50 μl，于濕盒中37 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗后加入3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diazobenzidine,DAB)底物 50 μl室溫孵育 10 min，隨后蘇木素復(fù)染、脫水、透明，封片后光鏡下觀察。每張病理切片隨機選取不交叉重復(fù)的5個視野在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，取5個視野的凋亡細(xì)胞平均值作為該樣本的凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.9 ELISA檢測

各組缺血再灌注24 h后，腹主動脈取血6 ml，室溫靜置4 h后，4℃下3000 r/min離心5 min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.10 Western blotting檢測

將保存于-80℃的各組大鼠腦組織各取100 mg左右，裂解液提取組織蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白樣品30 μl。12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，緩沖鹽溶液(tris buffered saline tween,TBST)沖洗；加入相應(yīng)的一抗(cleaved-caspase 3稀釋比1∶200、cleaved-caspase 9稀釋比 1∶200、Bax稀釋比1∶1000、Bcl-2稀釋比1∶1000、β-actin稀釋比1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST緩沖液再次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(稀釋比1∶2000)，室溫孵育1 h。洗膜，電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi luminescence,ECL)試劑對其曝光顯影，拍照保存、分析。

每組實驗重復(fù)3次，使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度定量，目的條帶/β-actin的比值為相對定量結(jié)果，計算3次相對定量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用Origin軟件制成直方圖。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分和腦梗死百分比

假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)腦組織梗死及神經(jīng)功能缺損癥狀。與假手術(shù)組相比，模型組腦組織梗死體積增加，神經(jīng)功能評分升高；與模型組相比，黃角顆粒組腦梗死體積顯著減小(P＜0.001)，神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P＜0.001)。見表1、圖1。

2.2 腦組織病理結(jié)構(gòu)

2.3 腦組織細(xì)胞凋亡

與假手術(shù)組相比，模型組腦組織凋亡率上升(P＜0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組的凋亡率下降(P＜0.05)。見表2、圖3。

2.4 血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平

與假手術(shù)組相比，模型組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平升高(P＜0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平降低(P＜0.05)。見表3。

2.5 腦組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和Bax的表達(dá)均升高(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P＜0.05)；與模型組相比，黃角顆粒組腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和Bax的表達(dá)均降低(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)升高(P＜0.05)。見表4、圖4。

圖1 各組腦組織TTC染色圖

表1 各組腦梗死體積及神經(jīng)功能評分比較

表2 各組腦組織凋亡率比較

圖2 各組腦組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色，200×，bar=50 μm)

圖3 各組腦組織細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，400×，bar=20 μm)

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

表4 各組大鼠腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bax和Bcl-2蛋白的相對定量

圖4 各組大鼠腦組織cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

3 討論

腦缺血再灌注損傷是大多數(shù)缺血性腦血管病的主要病理生理機制，腦組織局部產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡增加在腦缺血再灌注損傷中擔(dān)負(fù)重要角色[1]。因此，對于腦缺血再灌注損傷炎性因子以及細(xì)胞凋亡的研究顯得相當(dāng)重要。

本研究采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型，探討提前給予黃角顆粒治療的療效及對炎性因子和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，腦缺血再灌注模型大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損狀態(tài)，腦組織出現(xiàn)腦梗死病灶，呈現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞損傷、核固縮以及核溶解等病理狀態(tài)，腦組織細(xì)胞凋亡增加，腦組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失調(diào)，血清中炎性因子的表達(dá)增加。提前給予黃角顆粒治療的腦缺血再灌注大鼠病理損傷明顯減輕，腦組織細(xì)胞凋亡顯著減少，血清中炎性因子的表達(dá)顯著降低，提示黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷具有顯著療效。

研究表明，白細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞，細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等炎性介質(zhì)均參與機體的炎性反應(yīng)，腦缺血再灌注損傷可激活腦組織中的中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，過量表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，使其發(fā)揮吞噬作用以及免疫作用的同時，向細(xì)胞外釋放大量的細(xì)胞因子、氧自由基和溶酶體酶等炎性介質(zhì)，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，從而加重腦組織損傷[13-15]。

IL-1β是IL-1在腦組織中的主要形式，是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，其在正常腦組織中處于低表達(dá)水平，腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，主要由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，從而加重機體的局部炎癥反應(yīng)[16]。Caso等[17]的研究結(jié)果顯示，MCAO模型大鼠腦組織中IL-1β的表達(dá)水平在缺血再灌注損傷24 h達(dá)到高峰，表明IL-1β參與了炎癥反應(yīng)。

TNF-α具有廣泛的生物學(xué)功能，是參與炎癥反應(yīng)的重要因子之一，腦缺血損傷發(fā)生后，TNF-α表達(dá)水平快速升高可加劇血管炎癥反應(yīng)，增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死并加重腦組織損傷[18]。

IL-6是炎癥急性反應(yīng)期重要的細(xì)胞因子之一，主要由IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)，其表達(dá)失調(diào)與缺血再灌注損傷密切相關(guān)，在腦缺血急性期的表達(dá)水平顯著增高，并與其預(yù)后不良具有密切聯(lián)系[19]。葛建彬等[20]的研究表明，枸杞多糖能顯著降低缺血再灌注小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，對小鼠的腦損傷具有明顯的保護作用。

本研究中，黃角顆粒能降低腦缺血再灌注損傷大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，減輕其病理損傷程度，表明黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與其介導(dǎo)炎性因子的表達(dá)相關(guān)。

腦缺血再灌注損傷是一個多因素多環(huán)節(jié)相互作用的過程，其病理生理過程較復(fù)雜，其中細(xì)胞凋亡是介導(dǎo)其損傷的重要機制之一[21-22]。研究表明，caspases家族在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，caspases是細(xì)胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，caspase 3是下游最關(guān)鍵的凋亡調(diào)控蛋白，caspase 9參與細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，其表達(dá)失調(diào)與缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程密切相關(guān)[23]。機體在正常情況下，caspase 3和caspase 9處于非活化的狀態(tài)，當(dāng)機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時，通過caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)caspase切割并活化(如cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9)，最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

Bax與Bcl-2均屬于Bcl-2家族，分別具有促凋亡和抗凋亡作用[24-25]。蘭晶等[26]的研究表明，姜黃素可降低cleaved-caspase 3和Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，且對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注模型組大鼠腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和Bax的表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高，但Bcl-2的表達(dá)顯著降低。提前給予黃角顆粒治療可降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9和Bax的表達(dá)，升高Bcl-2的表達(dá)，改善其病理狀態(tài)。表明黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷的保護作用與其調(diào)控細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

綜上所述，黃角顆?？娠@著改善腦缺血再灌注大鼠的病理損傷，減少腦組織細(xì)胞凋亡，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低血清中炎性因子的表達(dá)，提示黃角顆粒對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。但其是否還通過其他信號通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步研究。