肉雞大腸桿菌的相關(guān)性研究

文│由佳 楊志強(qiáng) 徐文彬（山東省煙臺市畜牧獸醫(yī)工作站）

趙瑋（山東益生畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院）

李明舉（山東省煙臺市動物疫病預(yù)防與控制中心）

楊麗（山東省煙臺市牟平區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站）

一、材料與方法

1.材料。

（1）菌株及雞胚。煙臺地區(qū)祖代和父母代肉種雞場、規(guī)?；唐啡怆u場疑似大腸桿菌發(fā)病雞；肉種雞場的死亡雞胚、1日齡雛雞卵黃囊。從以上病料中分離到大腸桿菌43株；12日齡健康雞胚由山東益生種畜禽股份有限公司提供。

（2）培養(yǎng)基及試劑：普通瓊脂、麥康凱瓊脂、0.9%的生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DNA Marker、Taq PCR Master Mix、雙蒸水（ddH2O）、50×TAE、Agarose瓊脂糖、Goldview核酸染料等。

（3）主要儀器設(shè)備：TC-XP基因擴(kuò)增儀、DYY-11型電泳儀、GelDoc EZ全自動免染凝膠成像分析系統(tǒng)、SW-CJ-IC超凈臺、電子天平、TGL-16C臺式離心機(jī)、MTV-100多管漩渦混合器等。

2.方法。

（1）引物設(shè)計。根據(jù)GenBank已發(fā)表的毒力基因序列，用Primer5.0軟件設(shè)計出大腸桿菌13種毒力相關(guān)基因的13對特異性引物（表1）。

表1 毒力基因PCR擴(kuò)增引物

（2）模板制備。將大腸桿菌分離株接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)18～24小時，挑取數(shù)個單菌落，溶于1毫升滅菌的生理鹽水中，搖勻制成細(xì)菌懸液，100℃煮沸10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清500微升至滅菌離心管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）反應(yīng)體系及程序。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix（含有2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP）12.5微升，10皮摩爾/微升的上下游引物各0.5微升，7.5微升的ddH2O，4微升的模板。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5分鐘，進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃變性30秒，Tm退火30秒，72℃延伸45秒，共進(jìn)行30個循環(huán)。最后72延伸10分鐘，4℃保存。

（4）致病力試驗。在普通瓊脂培養(yǎng)基上挑取直徑約1.5毫米的單個純化菌落，至1毫升PBS溶液中，震蕩搖勻，倍比稀釋，將菌液濃度調(diào)整至200～300個菌落形成單位/毫升。用無菌注射器吸取0.1毫升菌液接種于12日齡健康雞胚尿囊腔中，每組接種10枚，設(shè)2枚對照，對照雞胚一枚不接種，另一枚接種0.1毫升的PBS溶液，連續(xù)觀察4天，記錄每天雞胚死亡數(shù)量。參照有關(guān)文獻(xiàn)，致病力在10%～30%的分離菌為低致病力菌株，40%～100%的分離菌為高致病力菌株。

二、結(jié)果與分析

雞胚致死試驗結(jié)果得出，43株分離菌中有高致病力菌株為26株，低致病力菌株為17株，分別占試驗菌株的60.47%、39.53%。

1.不同致病力菌株中毒力基因的檢出情況。由表2可知，iutA、iss、tsh、iucD、colV這五種毒力基因在高致病力分離菌中的檢出率明顯高于低致病力分離菌，其余8種毒力基因在高致病力菌株和低致病力菌株的檢出率差別不大或相同。

2.不同致病力菌株中毒力基因組合情況。4 3株致病力菌株中，26株高致病力菌株100%同時攜帶6～12種毒力基因；17種低致病力菌株同時攜帶6～12種毒力基因的菌株占低致病力菌株數(shù)量的76.47%，攜帶3、5種毒力基因的菌株占低致病力菌株總數(shù)的23.53%。結(jié)果顯示，攜帶基因數(shù)量小于6種的菌株均屬于低致病力菌株，而攜帶6～12種毒力基因的菌株在高、低致病力分離株中差異不明顯。

高致病力菌株中毒力基因共有12種組合形式，其中11種基因組合形式（FimA＋colBM＋iutA＋fyuA＋irp2＋iucA＋iss＋FimC＋tsh＋iucD＋colV）菌株數(shù)量最多，有9株，占高致病力分離株的34.62%，其次為12種基因組合形式（FimA＋colBM＋iutA＋yuA＋irp2＋iucA＋iss＋FimC＋tsh＋iucD＋papC＋colV），有5株，占高致病力分離株的19.23%。低致病力菌株中毒力基因共有11種組合形式，其中11種基因的組合形（FimA＋colBM＋iutA＋fyuA＋irp2＋iucA＋iss＋FimC＋tsh＋iucD＋colV）的菌株數(shù)量最多，有4株，占低致病力分離株的23.53%，其次為3種基因組合形式（FimA＋colBM＋FimC），有3株，占低致病力分離株的17.65%。

三、討論

國內(nèi)在禽源大腸桿菌毒力基因與致病力相關(guān)性方面做過一些研究。王利勤研究結(jié)果顯示，攜帶毒力基因數(shù)量與菌株的致病性呈正相關(guān)，毒力基因irp2、fyuA、iucA、iutA、FimA、papC、iss、tsh和colV在雞源高致病性大腸桿菌分離株中檢出率極顯著高于中低致病性分離株檢出率（P＜0.01）。高致病性菌株均同時攜帶13種毒力基因中8～12種基因，其中irp2＋fyuA＋iucD＋iucA＋iutA＋FimA＋FimC＋iss＋tsh＋colV＋colBM的11種基因組合攜帶率最高，為22.3%，其次為irp2＋fyuA＋iucD＋iucA＋iutA＋FimA＋FimC＋iss＋tsh＋colV＋papC＋colBM組合，為7.3%。低致病力分離株均同時攜帶除irp2、papC、hlyA和colV基因外的9種毒力基因中的2～4種毒力基因，其中iucD＋iutA＋FimC＋colBM毒力基因組合的檢出率最高，達(dá)20.7%，其次FimA＋FimC＋colBM組合，為17.2%。董向磊研究結(jié)果顯示，高致病菌株比低致病菌株出現(xiàn)頻率高的有iucC、iucD、iutA、tsh、iroN、irp-2、iss和cvaC這8個毒力基因，極顯著高于低致病力菌株檢出率的有iutA、iro、iss、tsh這4個毒力基因。

表2 43種致病性分離株毒力基因的檢出情況

本試驗結(jié)果顯示，43株分離株中5種毒力基因iutA、iss、tsh、iucD、colV在高致病力菌株中的檢出率明顯高于低致病力分離株，這與董向磊等的研究極為相似，與王利勤的部分研究結(jié)果稍有不同。本試驗結(jié)果中高致病力菌株11種基因的組合形式（FimA＋colBM＋iutA＋fyuA＋irp2＋iucA＋iss＋FimC＋tsh＋iucD＋colV）菌株數(shù)量最多，有9株，占高致病力分離株的34.62%，其次為12種基因的組合形式（FimA＋colBM＋iutA＋fyuA＋irp2＋iucA＋iss＋FimC＋tsh＋iucD＋papC＋colV），有5株，占高致病力分離株的19.23%；低致病力菌株中3種基因的組合形式（FimA＋colBM＋FimC），有3株，占低致病力分離株的17.65%。這與王利勤的研究結(jié)果有部分相同。本試驗結(jié)果中，43株分離株中的26株高致病力菌株100%同時攜帶6～12種毒力基因數(shù)量，17株低致病力菌株中有76.47%同時攜帶6～12種毒力基因，有23.53%同時攜帶3、5種毒力基因，攜帶基因數(shù)量小于6種的菌株均屬于低致病力菌株，而攜帶6～12種毒力基因的菌株在高、低致病力分離株中差異不明顯，這與王利勤攜帶毒力基因數(shù)量與菌株的致病性呈正相關(guān)的研究結(jié)果不同。也許致病力高低除了與毒力基因有關(guān)外，還可能受血清型、耐藥基因等其他因素影響，毒力基因與致病力相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。