瘤背石磺肌球蛋白重鏈(MyHC)基因的克隆與表達(dá)分析*

顧冰寧 劉 欣 沈和定 王冬鳳 楊鐵柱 朱 敏 史艷梅 李柏航

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瘤背石磺肌球蛋白重鏈()基因的克隆與表達(dá)分析*

顧冰寧#劉 欣#沈和定①王冬鳳 楊鐵柱 朱 敏 史艷梅 李柏航

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 海洋動物系統(tǒng)分類與進(jìn)化上海高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306)

肌球蛋白是動物體內(nèi)重要的功能性馬達(dá)蛋白，調(diào)控機(jī)體的信號傳導(dǎo)、肌肉收縮和細(xì)胞器運(yùn)動，為探究肌肉在瘤背石磺()由海洋向陸地進(jìn)化過程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)以石磺科4種貝類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用RACE方法從瘤背石磺肌肉中首次克隆到肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,)基因cDNA的全長并進(jìn)行組織表達(dá)分析。研究結(jié)果顯示，瘤背石磺基因cDNA全長為7566 bp，包括5895 bp的開放閱讀框，228 bp的5￠端非翻譯區(qū)，1443 bp的3￠端非翻譯區(qū)，共編碼1964個氨基酸。預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)由31713個原子組成，分子式為C9765H15897N2849O3150S52，分子量約為225.28 kDa，理論等電點(diǎn)為5.56，N端信號肽具有29個氨基酸長度。瘤背石磺具有2個保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l，且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，瘤背石磺與光滑雙臍螺()的親緣關(guān)系最近。RT-PCR結(jié)果顯示，基因在各個組織中均有表達(dá)，腹足和背部皮膚表達(dá)量最高，腹部皮膚、口球、肺囊中高表達(dá)，肝胰腺、蛋白腺、兩性腺中微量表達(dá)(<0.05)?；蛟诹霰呈堑闹饕\(yùn)動器官腹足中高表達(dá)，說明肌肉運(yùn)動對瘤背石磺濕地環(huán)境的兩棲適應(yīng)性具有至關(guān)重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后進(jìn)一步研究瘤背石磺肌球蛋白重鏈基因進(jìn)行原核表達(dá)及多克隆抗體的制備奠定了良好基礎(chǔ)，更為深入探討海洋無脊椎動物從海洋向陸地進(jìn)化的研究提供有參考意義的分子依據(jù)。

瘤背石磺；；基因克?。唤M織表達(dá)

瘤背石磺()是生活在潮間帶高潮區(qū)灘涂的一種肺螺類，隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、石磺科(Onchidioidea)，是一種具有重要營養(yǎng)價值和藥用價值的兩棲性貝類，廣泛分布于赤道兩側(cè)的熱帶和亞熱帶海區(qū)(吳旭峰等, 2010)，國內(nèi)主要分布在江蘇以南沿海地區(qū)。石磺科貝類呈現(xiàn)從海洋向陸地擴(kuò)展的梯度分布狀態(tài)(Dayrat, 2009)，深入研究其輻射過程會更好地了解海洋無脊椎動物由海棲向陸棲的宏觀進(jìn)化模式(Bouchet, 2005)。近年來，其線粒體基因組(Sun, 2014; 王冬鳳等, 2015)、群體多樣性分析(姚理想等, 2015)以及分子標(biāo)記開發(fā)(王成暖等, 2014)的研究較多，但與性狀相關(guān)功能基因的研究報道較少。石磺的真皮含有大量縱橫排列的肌纖維，能顯著增強(qiáng)皮膚的彈性和韌性(Liu, 2014)。作為兩棲性最為明顯(不能長時間淹沒在水中，也不能長期在干燥環(huán)境中生活)的瘤背石磺，腹足中含有的大量肌纖維，在其及時快速躲避海水淹沒等運(yùn)動過程中起著非常重要的作用。

肌球蛋白(Myosin)是骨骼肌纖維粗肌絲的基本組成單位，約占肌原纖維蛋白的二分之一以上，具有結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的雙重性質(zhì)，是動物體內(nèi)重要的功能性馬達(dá)蛋白(Knight, 2000)，在機(jī)體的信號傳導(dǎo)、肌肉收縮、細(xì)胞器運(yùn)動等方面起著重要的調(diào)控作用(Hooper, 2005)。肌球蛋白分子為“Y”形不對稱六聚體結(jié)構(gòu)，由2條重鏈亞基和4條輕鏈亞基組成，重鏈亞基由位于氨基端球狀結(jié)構(gòu)的肌球蛋白頭部和位于羧基端具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的輕酶解肌球蛋白構(gòu)成，分子量約為200 kDa，肌球蛋白頭部含有1個ATP和肌動蛋白(actin)結(jié)合位點(diǎn)(Craig, 2006)，輕鏈亞基具有使肌球蛋白在生理條件下形成絲狀的能力(Pett, 2000)，分子量約為16~20 kDa。單個肌球蛋白分子沒有功能，不能參與細(xì)胞生理過程，必須聚合成排列有序的粗肌纖維才能完成一個完整的生命活動。

近年來，隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)界對各類物種的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因，特別是肌球蛋白重鏈()基因的研究也越來越多。目前，在對肌球蛋白基因的研究中，大多數(shù)的研究對象是脊椎動物，而有關(guān)無脊椎動物的研究報道甚少。目前，已經(jīng)對多個物種的肌球蛋白重鏈基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)，包括人() (Jaenicke, 1990)、大鼠() (Strehler, 1986)、雞()(Molina, 1987)、鵝() (李艷艷等, 2015)以及魚類中的大麻哈魚() (Iwami, 2002)、鯉魚() (Muramatsu, 2005)、翹嘴鱖() (陳之航等, 2017)等，與這些物種基因相對應(yīng)的核酸分子雜交探針也陸續(xù)制備出來，已達(dá)到對C進(jìn)一步深入細(xì)致研究的效果(Lied, 1985)。

本研究是在實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊對石磺肌肉理化性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，選擇在我國分布廣泛、產(chǎn)量大、兩棲性最為明顯的瘤背石磺作為實(shí)驗(yàn)對象，以石磺科貝類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，差異分析后篩選、克隆了瘤背石磺C基因的cDNA全長，對其序列進(jìn)行同源性分析，并測定分析其在不同組織中的表達(dá)狀態(tài)，為研制基因核酸雜交探針提供了基礎(chǔ)資料，也為進(jìn)一步分析石磺科貝類的肌肉生長規(guī)律、探究無脊椎動物從海生到陸生的適應(yīng)性進(jìn)化過程及分子機(jī)制作有益嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用瘤背石磺采自上海市崇明島，采回樣品放置于北向?qū)嶒?yàn)室暫養(yǎng)箱中進(jìn)行暫養(yǎng)，定時向暫養(yǎng)箱中投放玉米粉，清理排泄物，增添清水，并及時清除死亡個體。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前體重為(10.68±0.11) g，肌肉舒展?fàn)顟B(tài)下體長為(5.82±0.12) cm。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 取瘤背石磺的背部皮膚、腹部皮膚、口球、腹足、肝胰腺、蛋白腺、兩性腺、肺囊部位，采用Trizol(TaKaRa, 大連)試劑提取總RNA，提取方法參照使用說明書，用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國)檢測提取的RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以瘤背石磺腹足總RNA為模板，用SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit(Clontech, 日本)按照操作指南合成RACE cDNA第一條鏈。

1.2.2基因克隆 根據(jù)已有的瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過基因差異表達(dá)分析、GO功能顯著性富集分析和KEGG pathway顯著性分析，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出一條與肌肉生長相關(guān)的關(guān)鍵序列(S_Unigene106_c0_seq1)，在NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果為基因。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物MyHC-F1、MyHC-R1(表1)，擴(kuò)增目的基因片段，25 μl體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 0.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，(5 U/μl) 0.3 μl，ddH2O 18.7 μl，cDNA 1 μl。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒(天根, 北京)割膠回收目的條帶，并與pGEM-T Easy (Promega, 美國)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，熱轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌后涂布于含氨芐的選擇性培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測后將陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究用到的引物

Tab.1 Primers used in this study

根據(jù)獲得的基因序列，分別設(shè)計3￠和5￠RACE特異性引物(表1)，按照Clontech RACE說明書分別進(jìn)行3￠RACE和5￠RACE擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、連接和轉(zhuǎn)化后，通過菌落PCR，挑選陽性克隆樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將所獲序列和已知序列進(jìn)行拼接，獲得基因的全長，并通過重測序消除不確定堿基。

1.2.3 序列分析 利用在線工具ProtParam、NetPhos 2.0 Server、ORF Finder、Signal 4.1等分別對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析；用Phyre2程序預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；以日本三角渦蟲()為外群采用MrBayes-3.2.6和MEGA 6.0軟件用鄰位法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1000次bootstraps，其他參數(shù)均使用默認(rèn)值。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)挑選9個目測健康、大小均一的瘤背石磺，分別取其背部皮膚、腹部皮膚、口球、腹足、肝胰腺、蛋白腺、兩性腺和肺囊8個組織，將每3個個體的相同器官或組織等量混合作為一個樣品，共制成3個樣品組，提取總RNA并將其反轉(zhuǎn)為cDNA，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)已獲得的基因序列，設(shè)計熒光定量引物MyHC-RT-F和MyHC-RT-R(表1)，以18S rRNA為內(nèi)參。實(shí)時熒光定量PCR采用SYBR premix ExTMⅡ試劑盒(TaKaRa, 大連)在CFX-96(Bio-Rad, 美國)實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行。采用相對定量2-ΔΔCt法(Livak, 2001)計算目的基因的相對表達(dá)量?；虻谋磉_(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，使用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MyHC cDNA的全長序列

瘤背石磺的cDNA(GenBank登錄號：KU550708)全長為7566 bp，包括5895 bp的開放閱讀框，228 bp的5￠端非翻譯區(qū)(UTR)，1443 bp的3￠端非翻譯區(qū)(UTR)。3￠UTR區(qū)含有典型的多聚核苷酸加尾信號序列AATAAA和Poly(A)尾巴(圖1)。NCBI進(jìn)行Blast比對，顯示該序列與光滑雙臍螺()相似性為92%，與加州海兔()相似性為89%，與二者的相似性均較高。

2.2 MyHC的結(jié)構(gòu)特征

推導(dǎo)該序列共編碼1964個氨基酸，分子量約為225.28 kDa，理論等電點(diǎn)為5.56。谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)和賴氨酸(Lys)含量最高，分別為13.2%、10.5%和10.1%；色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)含量最少，分別為0.5%、0.6%和1.4%(表2)。帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)366個，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)324個。原子總量31713，分子式為C9765H15897N2849O3150S52。不穩(wěn)定指數(shù)為47.48。

信號肽的預(yù)測結(jié)果顯示，信號肽切割位點(diǎn)存在于第29和30個氨基酸殘基之間，表明N-端具有一個由29個氨基酸組成的信號肽。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示有74個Ser、41個Thr、9個Tyr，可能是磷酸化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示有4個N糖基化位點(diǎn)。利用Blastp將蛋白序列與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的全部蛋白序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，瘤背石磺肌球蛋白重鏈按其結(jié)構(gòu)有4個ATP結(jié)合位點(diǎn)，1個P-loop、1個SH1 helix、1個switch II region、1個switch I region、2個converter subdomain、1個purine-binding loop、1個relay loop，同時包括2個保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l結(jié)構(gòu)域，MyHC Myosin_tail_l結(jié)構(gòu)域與其他物種MyHC序列進(jìn)行比對見圖2，肌球蛋白重鏈三級預(yù)測結(jié)構(gòu)如圖3。

基因序列編碼區(qū)用大寫字母表示，非編碼區(qū)用小寫字母表示。下劃線表示Poly(A)尾巴，雙下劃線表示Myosin_tail _l結(jié)構(gòu)域，陰影部分為AATAAA加尾信號

The UTR and ORF regions are shown in lowercase and uppercase letters, respectively; underline is the polyadenylation signal; Myosin_tail _l domain is double underlined; the shadow is the putative eukaryotic polyadenylation signal (AATAAA)

表2 瘤背石磺MyHC多肽鏈的氨基酸組分

Tab.2 Amino acid composition of MyHC from O. struma

2.3 同源性分析

為分析瘤背石磺的進(jìn)化地位，根據(jù)MyHC氨基酸序列，使用MrBayes-3.2.6和MEGA6.0(前者為MrBayes分析結(jié)果，后者為MEGA分析結(jié)果)構(gòu)建了包括瘤背石磺在內(nèi)的19個物種MyHC序列(表3)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，無脊椎動物和脊椎動物分為兩支，瘤背石磺和光滑雙臍螺的MyHC聚類成一個分支，然后與加州海兔聚在一起，海灣扇貝()、歐洲大扇貝()和長牡蠣()聚在一起，日本矛魷魚()、金烏賊()和章魚()聚在一起，脊椎動物方面按照形態(tài)學(xué)分類地位聚類(圖4)。

“*”表示保守的氨基酸殘基，“.”表示相似性氨基酸

“*” indicates highly conserved amino acid residue; “.” represents similar amino acid

圖3 預(yù)測的瘤背石磺MyHC三級結(jié)構(gòu) Fig.3 The predicted tertiary structures of O.struma MyHC

表3 其他物種的NCBI登錄號

Tab.3 Accession numbers of MyHC from other species

2.4 不同組織的表達(dá)差異分析

以18S rRNA為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測瘤背石磺基因在背部皮膚、腹部皮膚、口球、腹足、肺囊、肝胰腺、蛋白腺和兩性腺8個組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，基因在各個組織中均有表達(dá)；腹足和背部皮膚表達(dá)量最高，腹部皮膚、口球和肺囊中高表達(dá)，肝胰腺、蛋白腺和兩性腺中微量表達(dá)且表達(dá)差異顯著(<0.05) (圖5)。

圖4 基于MyHC氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹

圖5 MyHC在瘤背石磺不同組織的表達(dá)

相同字母表示差異不顯著(>0.05)，不同字母表示差異顯著(<0.05)

Same letters above the bars indicate no significant difference (>0.05), statistical significance is presented by different letters (<0.05)

3 討論

3.1 瘤背石磺MyHC基因的存在形式

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，瘤背石磺的MyHC與光滑雙臍螺的MyHC聚成一個分支，其次是加州海兔，這與它們的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，而且從系統(tǒng)進(jìn)化樹也能看出各物種從低等到高等、從水生到陸生的進(jìn)化規(guī)律，表明肌球蛋白重鏈?zhǔn)茄芯可镞M(jìn)化良好的備選基因。

同時有研究顯示，脊椎動物中大部分都含有多種肌球蛋白重鏈基因和亞型，在禽類中至少有9種基因被鑒定(Kropp, 1987; Bandman, 2000)，在哺乳動物中至少也有13種，其中，8種來自于橫紋肌，5種來自于光滑肌和非肌肉組織(Weiss, 1999; Flück, 2003)。在魚類肌球蛋白重鏈多基因家族研究中，分別從虹鱒()的紅肌、白肌和胸肌中獲得3種不同的cDNA片斷(Weaver, 2001)；從翹嘴鱖中克隆得到紅肌肌球蛋白重鏈cDNA片段(易潭等, 2014)。Nakaya等(1995)發(fā)現(xiàn)肌球蛋白分子α-螺旋結(jié)構(gòu)會因基因亞型的差異出現(xiàn)顯著的不同，Imai等(1997)和Huriaux等(1991)發(fā)現(xiàn)了在不同溫度下的不同類型的cDNA。斑馬魚()的骨骼肌纖維也存在3種不同的類型，應(yīng)存在不同的基因的亞型，而不同的基因的亞型在不同的肌纖維中的表達(dá)也存在較大的差異。瘤背石磺中是否存在基因亞型，以及存在哪幾種基因亞型還有待進(jìn)一步研究判斷。

3.2 瘤背石磺MyHC基因蛋白結(jié)構(gòu)分析

本研究克隆獲得瘤背石磺MyHC具有典型的保守結(jié)構(gòu)組件，4個ATP結(jié)合位點(diǎn)，1個SH1螺旋，3個Loop環(huán)，2個轉(zhuǎn)換區(qū)域，2個轉(zhuǎn)換子區(qū)域，這些氨基酸殘基組成了瘤背石磺MyHC兩個保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l的特性。其中，MYSc_ class_Ⅱ位于第33~256位氨基酸，Myosin_tail _l位于第881~1925位氨基酸，位于蛋白尾部，由卷曲的肌球蛋白重鏈尾部區(qū)域構(gòu)成，為粗肌絲提供了結(jié)構(gòu)支撐。已知MyHC家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)主要是由N端球狀盤繞的頭部和C端α-螺旋型的尾部組成，頭部有ATP結(jié)合位點(diǎn)、Loop1和Loop2環(huán)區(qū)，是MyHC家族中的保守區(qū)，同時也是肌球蛋白動力產(chǎn)生的主要區(qū)域，Loop1表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定肌纖維收縮速率以及持續(xù)的動力，而Loop2表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)則影響MyHC上游肌動蛋白激活的ATP酶水解活性(Holmes, 2002)。另外，在MyHC中還發(fā)現(xiàn)了SH1螺旋。SH1修飾肌球蛋白亞片段能大大提高其熱穩(wěn)定性，SH1可以大大減少整個肌球蛋白亞片段的改變(Lubov, 2007)，其對肌纖維運(yùn)動等功能有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。本研究獲得的瘤背石磺MyHC的蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘤背石磺MyHC蛋白MYSc_class_Ⅱ結(jié)構(gòu)域疏水性氨基酸所占的比例較大。目前，劉希良等(2012)根據(jù)已經(jīng)克隆的鱖魚序列制備出原核表達(dá)載體和多克隆抗體。瘤背石磺肌球蛋白重鏈Myosin_tail _l保守區(qū)域中親水性氨基酸較多，屬于親水性氨基酸密集區(qū)域，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對深入研究石磺肌球蛋白重鏈基因的原位雜交實(shí)驗(yàn)、Western blot檢測奠定了基礎(chǔ)。

在對目前哺乳動物骨骼肌中基因進(jìn)行研究時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種途徑可以調(diào)控該基因的同型異構(gòu)體表達(dá)，其中有兩條途徑研究較多，分別是通過肌源調(diào)節(jié)因子(Myogenic regulatory factor, MRF)和活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factor of activated T cells, NFAT)(Devoto, 1996)。前者由MyoD、myogenin、myfS和MRF4這4個蛋白組成，后者調(diào)控途徑的主要方式是通過調(diào)節(jié)Ca2+的濃度的變化。研究表明，當(dāng)肌肉收縮時，釋放Ca2+數(shù)量增多，相應(yīng)的細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度就會上升，而升高的Ca2+濃度會通過一系列的化學(xué)反應(yīng)來激活下游相應(yīng)的蛋白，由此使得細(xì)胞質(zhì)中某些蛋白質(zhì)進(jìn)行脫磷酸化，隨后進(jìn)入細(xì)胞核中，與一個保守的DNA結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，以此來調(diào)節(jié)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄水平的變化(Tao, 2004)。Kubis等(1997)在對兔培養(yǎng)的肌細(xì)胞進(jìn)行研究時，將Ca2+載體加入培養(yǎng)基中，使肌漿中Ca2+濃度緩慢升高，發(fā)現(xiàn)此時肌細(xì)胞中慢型肌球蛋白重鏈和輕鏈的比例較高。在對石磺基因構(gòu)成的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析時，發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)段以及許多磷酸化位點(diǎn)，例如蛋白激酶C的活性必須依賴Ca2+的存在。雖然現(xiàn)在沒有確切的證據(jù)表明石磺內(nèi)有相似的調(diào)控機(jī)制來控制基因的特異性表達(dá)，但可以為今后探究石磺的肌球蛋白的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

3.3 MyHC基因的表達(dá)與環(huán)境適應(yīng)性分析

研究證實(shí)，基因的表達(dá)量會顯示出對于周圍環(huán)境變化的適應(yīng)和調(diào)節(jié)，Altringham等(1985)發(fā)現(xiàn)鯉魚會通過基因的表達(dá)量的不同來調(diào)節(jié)ATP酶的活性以適應(yīng)溫度的變化。Nihei等(2006)通過對鯉魚胚胎和肌肉組織中的基因表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚基因不僅在不同發(fā)育階段、不同肌肉類型表現(xiàn)出表達(dá)量的差異，而且在不同溫度下也會存在這種差異。此外，在其他魚類品種中，Weaver等(2001)利用RT-PCR檢測幼魚階段虹鱒的平滑肌、骨胳肌和心肌中基因表達(dá)，顯示平滑肌表達(dá)基因的表達(dá)略高于骨骼肌和心肌，在進(jìn)一步對魚苗期和幼魚期的平滑肌中基因表達(dá)量進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)，幼魚期基因表達(dá)量高于魚苗期。本研究中，在腹足部位高表達(dá)，同時在其他各個組織中都進(jìn)行表達(dá)，充分證明肌球蛋白既是一種不可缺少的結(jié)構(gòu)蛋白，同時又能作為功能蛋白發(fā)揮作用；腹足作為瘤背石磺的運(yùn)動器官，在該器官中表達(dá)量最高，增強(qiáng)了瘤背石磺的運(yùn)動能力，為瘤背石磺逐漸適應(yīng)陸生環(huán)境提供了有力的條件。

4 結(jié)論

本研究從瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中篩選到Unigenes，進(jìn)行了cDNA序列克隆、結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化分析以及qRT-PCR表達(dá)水平分析。結(jié)果表明，瘤背石磺基因的結(jié)構(gòu)特征主要有：存在多個N-糖基化位點(diǎn)，MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l兩個保守結(jié)構(gòu)域，N末端具有多個ATP結(jié)合位點(diǎn)等特異性功能區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，瘤背石磺基因與光滑雙臍螺聚成一支，其符合形態(tài)學(xué)分類且物種等級相近；表達(dá)水平分析顯示，瘤背石磺基因具有不同的組織分布，在組織運(yùn)動最發(fā)達(dá)的腹足有高水平的表達(dá)。通過對瘤背石磺基因結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測、組織表達(dá)以及分子進(jìn)化的分析，為進(jìn)一步探究石磺肌球蛋白的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)；為探究肌肉運(yùn)動對瘤背石磺濕地環(huán)境兩棲適應(yīng)性的相關(guān)聯(lián)系；對研究瘤背石磺肌球蛋白重鏈基因進(jìn)行原核表達(dá)及多克隆抗體的制備提供基礎(chǔ)資料，更為深入探討海洋無脊椎動物從海洋向陸地進(jìn)化的研究提供有參考意義的分子依據(jù)。

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(編輯 馮小花)

Molecular Cloning and Analysis of theGene in

GU Bingning, LIU Xin, SHEN Heding①, WANG Dongfeng, YANG Tiezhu, ZHU Min, SHI Yanmei, LI Bohang

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education; National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education; Shanghai Universities Key Laboratory of Marine Animal Taxonomy and Evolution, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

belongs to Mollusca, Pulmonata, and was regarded asthe transitional taxa from water to land because of its amphibious characteristics. Having similar characters to amphibians,is a good subject for the study of marine invertebrates extending landward. As the basic component of muscle units, myosin directly influences the muscle growth and meat qualityits molecular diversity and composition. It is a ubiquitous eukaryotic motor protein that interacts with actin to generate the force for cellular movements, ranging from cytokinesis to muscle contraction. In this study, we used rapid amplification cDNA ends (RACE) methods to obtain the full-length cDNA of the myosin heavy chain () gene in. We performed bioinformatic and expression pattern analysis ofmRNA in different tissues detected by real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR). The full length of thecDNA sequence consists of 7566 base pairs (bp) comprising a 228 bp 5' untranslated region (UTR), a 1443 bp 3' UTR, and a 5895 bp open reading frame (ORF) which encodes 1964 amino acids.gene was expressed in various tissues; its highest expression was found in the foot and its lowest in the hepatopancreas (<0.05). Moreover, theprotein was predicted to be composed of 31,713 atoms and its formula is C9765H15897N2849O3150S52, with a calculated relative molecular weight of 225.28 kDa and a pof 5.56. The result of signal peptide prediction shows that the N-terminal has a signal peptide of 29 amino acids in length. Additionally, common features were found in theof, including MYSc class II and myosin tail l domain. Molecular phylogenetic analysis shows thatis closely related to. This study provided a novel myosin heavy chain gene sequence inand the results indicate that thegene is important for the growth and development of this animal, as well as its muscle characterization. Furthermore, the results revealed thatis not only an essential structural protein, but also a functional protein inConclusivelyis an excellent candidate gene for studying biological evolution.

;; Gene cloning; Tissue expression

SHEN Heding, E-mail: hdshen@shou.edu.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20180130001

S917.4

A

2095-9869(2018)04-0126-13

* 國家自然科學(xué)基金項目(41276157)和上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (41276157), and Shanghai University Fisheries First-Rate Discipline Construction Projects]. #: 共同第一作者。顧冰寧，E-mail：604923111@qq.com；劉 欣，E-mail：dxliu2090@163.com

沈和定，教授，E-mail: hdshen@shou.edu.cn

2018-01-30,

2018-03-28

顧冰寧, 劉欣, 沈和定, 王冬鳳, 楊鐵柱, 朱敏, 史艷梅, 李柏航. 瘤背石磺肌球蛋白重鏈()基因的克隆與表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 126–138

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