脊尾白蝦E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蛻皮分期的表達(dá)分析*

許 楊 王佳佳 葛倩倩 崔彥婷 馬 驪 李 健,2

?

脊尾白蝦基因克隆及、和在不同蛻皮分期的表達(dá)分析*

許 楊1王佳佳1葛倩倩1崔彥婷1馬 驪1李 健1,2①

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

本研究在克隆脊尾白蝦()基因(, GenBank No. KY471317)的基礎(chǔ)上，探討了其在蛻皮過程中的作用，同時也探討了克隆脊尾白蝦的蛻皮激素受體基因()和維甲酸X受體基因()在不同蛻皮分期的表達(dá)特征?？寺〉幕蛉L為3944 bp，包括2520 bp的開放閱讀框(ORF)。該開放閱讀框編碼一個由839個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為92.307 kDa，理論等電點為7.48。EcE75蛋白包含1個C4鋅指結(jié)構(gòu)，1個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且有1個明顯的跨膜螺旋?；蛟谶M(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動物聚為一支，與三疣梭子蟹()、黑背地蟹()、凡納濱對蝦()、中國明對蝦()等親緣關(guān)系最近?；蛟诩刮舶孜r的各組織中均有表達(dá)，其中，眼柄中的表達(dá)量最高，卵巢次之。在不同蛻皮分期中，與、的表達(dá)規(guī)律基本一致，生殖蛻皮前期和后期表達(dá)量都比生長蛻皮高。生長蛻皮和生殖蛻皮因為卵巢發(fā)育而存在明顯不同，蛻皮激素對卵巢發(fā)育的刺激作用，通過、和基因的表達(dá)上調(diào)可以體現(xiàn)出來。對、和基因在不同蛻皮分期的表達(dá)研究，為了解蝦蟹類蛻皮機(jī)制提供了參考信息。

脊尾白蝦；；；；蛻皮期

蛻皮貫穿甲殼動物的整個生活史，與其生長、發(fā)育和繁殖息息相關(guān)。蛻皮主要受互為拮抗的Y-器官分泌蛻皮激素(MH, 蛻皮甾類)和眼柄內(nèi)X-器官竇腺復(fù)合體分泌蛻皮抑制激素(MIH)影響。蛻皮激素是調(diào)控甲殼動物蛻皮及變態(tài)發(fā)育的重要激素，它的活性形式是20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)。在昆蟲體內(nèi)，蛻皮激素受體(Ecdysteroid receptor, ECR)與超氣門蛋白(Ultraspiracle, USP)形成異源二聚體，在甲殼動物體內(nèi)，ECR與維甲酸X受體(Retinoid X receptor, RXR)形成異源二聚體(Yao, 1994; Verhaegen, 2011)。這些二聚體與20E結(jié)合后形成的受體復(fù)合物直接激活E75等蛻皮激素早期應(yīng)答因子，形成初級應(yīng)答反應(yīng)(Riddiford, 2003; Thummel, 2002)。早期應(yīng)答因子誘導(dǎo)表達(dá)的蛻皮激素次級應(yīng)答基因級聯(lián)放大蛻皮激素信號，對蛻皮、變態(tài)、生殖等生理過程起調(diào)控作用(Dubrovsky, 2005)。在昆蟲中，基因首先在果蠅(Drosophilidae)中分離得到，Crossgrove等(2008)研究表明，對果蠅的蛻皮、變態(tài)及成蟲雌蠅的卵室發(fā)育有重要作用。果蠅存在和三種亞型，突變使幼體發(fā)育過程中蛻皮激素水平降低，導(dǎo)致發(fā)育遲緩、蛻皮缺陷等現(xiàn)象(Bialecki, 2002)。突變對生長發(fā)育和繁殖無明顯影響，突變導(dǎo)致果蠅在成蟲期死亡。在甲殼動物中，首先在刀額新對蝦()中分離鑒定，而后又在中國明對蝦()、三疣梭子蟹()、凡納濱對蝦()、黑背陸地蟹()和大型蚤()等物種中被分離鑒定(Chan, 1998; Priya, 2010; Qian, 2014; Kim, 2005; Hannas, 2010; Litoff, 2014)。對在甲殼動物蛻皮激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究較少。

學(xué)者們對脊尾白蝦()的蛻皮相關(guān)基因進(jìn)行了研究，梁俊平等(2015)克隆了基因，并分析其在卵巢和胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況。柳飛等(2016)克隆了基因，并分析其在溫度、鹽度脅迫和蛻皮周期中的表達(dá)情況。張美等(2016)克隆了基因，并分析其在pH和氨氮脅迫中的表達(dá)規(guī)律。而關(guān)于脊尾白蝦的基因的研究至今尚未見報道。因此，本研究結(jié)合脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆基因cDNA全長，通過熒光定量PCR分析了該基因在脊尾白蝦的組織表達(dá)分布及在不同蛻皮分期和的表達(dá)規(guī)律，以比較生長蛻皮和生殖蛻皮的不同，為了解蝦蟹類蛻皮機(jī)制提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脊尾白蝦取自山東省日照海辰水產(chǎn)有限公司，均為活力好、大小均勻的健康個體，體長為(5.42± 0.34) cm，體重為(1.58±0.22) g。將實驗用蝦暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶50尾，暫養(yǎng)海水鹽度為31，pH為8.2，水溫為24℃，24 h持續(xù)通氣充氧。每天早晚2次飼喂蛤蜊肉，吸污換水1/3，連續(xù)養(yǎng)殖7 d后開始實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 2種蛻皮的區(qū)分及樣品處理 未性成熟的脊尾白蝦處于生長期，該組實驗蝦的蛻皮為生長蛻皮。性成熟的實驗蝦分為卵巢發(fā)育蝦和抱卵蝦，其中，卵巢發(fā)育且?guī)в懈顾{(lán)者的蛻皮為生殖蛻皮。根據(jù)中華鋸齒米蝦()(王戰(zhàn)芳, 2014)和凡納濱對蝦(Gao, 2015)的方法進(jìn)行蛻皮分期，分為蛻皮間期(C期)、蛻皮后期(軟皮期，AB期)、蛻皮前期(D期，取自特征明顯的D2亞期)。實驗用蝦暫養(yǎng)1周后，挑選活力好、無殘缺的個體，用解剖剪剪取尾節(jié)末端，置于倒置顯微鏡，觀察分期并拍照。將確定分期的脊尾白蝦每尾蝦取0.1 ml血與0.1 ml預(yù)冷的抗凝劑混合，于4℃下5000 r/min離心10 min，棄上清液后加入1 ml Trizol，然后，再采集肝胰腺、鰓、肌肉、腸、胃、眼柄、大顎器、表皮、外殼、腹神經(jīng)節(jié)、卵巢和心共12種組織。液氮研磨后，稱取50 mg樣品，置于無RNA酶離心管中，并加入1 ml Trizol，震蕩混勻后，置于–80℃冰箱保存。每個平行取3尾，每個蛻皮分期共3個平行。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 采用Trizol試劑法提取各組織的總RNA，核酸定量儀(NanoDrop 2000, Thermo)測定純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度及完整性。利用SMARTTMRACE Amplifica- tion Kit (Clontech)合成cDNA模板。

1.2.3基因cDNA全長的克隆 根據(jù)實驗室脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和NCBI上Blast的比對結(jié)果，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物和(表1)，以1.2.2中合成的cDNA為模板，使用HiFi酶進(jìn)行基因中間片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：cDNA模板1 μl，HiFi Buffer 2 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 1.6 μl，引物(上、下游)各1 μl，HiFi酶(5 U/ml) 0.2 μl，滅菌水補(bǔ)至20 μl。

PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的TAE瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit (TaKaRa)切膠回收，并純化檢測。切膠回收產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接后，將5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μl Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。在含AMP、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單一白斑菌落繼續(xù)培養(yǎng)6 h。菌落PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對，此序列片段與其他物種的基因同源性較高，確定為脊尾白蝦的基因序列片段。

根據(jù)上述擴(kuò)增得到的中間片段利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3￠和5￠RACE引物E75 3￠RACE和E75 5￠RACE(表1)，用于RACE擴(kuò)增基因cDNA全長序列。使用Smart Race試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行3′RACE和5￠RACE PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為3￠/5￠RACE cDNA 0.5 μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.0 μl，dNTP(10 mmol/L) 0.2 μl，3￠/5￠引物格0.2 μl，50× Advantage 2 Polymerase 0.2 μl，UPM(10×) 1 μl，PCR級H2O 6.9 μl。PCR反應(yīng)程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.5℃；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 3 min，20個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測序與基因中間片段的克隆方法相同。

1.3 EcE75基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y序所得的中間片段和3￠、5￠末端序列進(jìn)行拼接，得到基因全長。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/)和Gene Tool軟件預(yù)測開放閱讀框(ORF)和蛋白質(zhì)序列。使用Predict Protein和SMART服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測和功能結(jié)構(gòu)域分析。使用TMpred進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用ClustalX和DNAman軟件對脊尾白蝦和其他物種的E75氨基酸序列進(jìn)行比對分析，并用MEGA 6.07軟件以鄰接法(Neighbour- Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1000次Bootstrap重復(fù)檢驗進(jìn)化樹的置信度。

1.4 EcE75基因組織表達(dá)分析

根據(jù)已獲得的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對特異引物E75RT-F和E75RT-R，并以脊尾白蝦18S rRNA為內(nèi)參基因設(shè)計引物18sF與18sR (表1)。利用Real-time PCR檢測脊尾白蝦不同組織基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系和程序參考FS Universal SYBR Green Master(ROX)說明書，采用10 μl反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min； 95℃ 15 s。實驗中每3尾混合作為1個樣品，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用2?DDCt法計算脊尾白蝦基因在各組織中的相對表達(dá)量。

1.5 EcRXR、EcECR和EcE75基因在不同蛻皮分期的組織表達(dá)分析

根據(jù)GenBank的基因序列(GenBank No. KU647675)，(GenBank No. KC506600)，(GenBank No. KY471317)，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計特異引物RXRRT-F、RXRRT-R；EcRRT-F、EcRRT-R；E75RT-F、E75RT-R，并以脊尾白蝦18S rRNA為內(nèi)參基因設(shè)計引物18sF與18sR，對生長蛻皮和生殖蛻皮不同分期眼柄中基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。

表1 研究所用的引物序列

Tab.1 Primers used in this study

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗，<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcE75基因cDNA全長克隆及序列分析

通過RACE技術(shù)成功獲得基因cDNA序列全長。該基因全長為3944 bp，包括2520 bp的開放閱讀框(ORF)，450 bp的5￠非編碼區(qū)(5′UTR)和 974 bp的3￠非編碼區(qū)(3￠UTR)。經(jīng)PredictProtein軟件預(yù)測，基因編碼一個由839個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為92.307 kDa，理論等電點為7.48，脂溶系數(shù)為77.07，親水指數(shù)(GRAVY)為–0.417。經(jīng)SMART服務(wù)器預(yù)測，EcE75蛋白包含1個C4鋅指結(jié)構(gòu)(位于第32~104個氨基酸之間)、1個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(位于第207~366個氨基酸之間)及6個低組分復(fù)雜區(qū)域(分別位于第396~408個氨基酸、第419~443個氨基酸之間、第499~514個氨基酸之間、第574~627個氨基酸之間、第685~691個氨基酸之間以及第716~736個氨基酸之間)，具體位置見圖1。經(jīng)TMpred軟件預(yù)測，基因有1個明顯的跨膜螺旋，跨膜方向為由內(nèi)向外，由第297~313個氨基酸構(gòu)成，得分為580，預(yù)測結(jié)果見圖2。

虛線下劃線表示C4鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域，方框表示配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，小方框(ATG)表示起始密碼子，小方框*表示終止密碼子，其他下劃線表示6個低組分復(fù)雜區(qū)域

The dotted line represents the C4 zinc finger structure, the box represents the ligand binding domain, the small box (ATG) represents the start codon, the small box * indicates the stop codon, and the underlines represent the 6 low component complex regions

圖2 EcE75跨膜螺旋預(yù)測

2.2 EcE75蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

經(jīng)過多序列比對發(fā)現(xiàn)，EcE75蛋白與三疣梭子蟹、凡納濱對蝦、中國明對蝦、黑背陸地蟹、刀額新對蝦同源性較高，可以證明此序列就是脊尾白蝦的E75蛋白(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，EcE75蛋白在進(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動物聚為一支，與三疣梭子蟹、黑背陸地蟹、凡納濱對蝦、中國明對蝦等親緣關(guān)系最近，相似性分別為79%、79%、78%和78%(圖4)。

2.3 EcE75基因組織表達(dá)分析

采用RT-PCR方法檢測脊尾白蝦肝胰腺、鰓、肌肉、腸、血、胃、心、表皮、殼、卵巢、眼柄、大顎器和腹神經(jīng)節(jié)共13種組織中基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，基因在13種組織中均有表達(dá)，眼柄表達(dá)量最高，卵巢次之，肌肉和血細(xì)胞表達(dá)量較低，肝胰腺中最低(圖5)。

KY471317;ACF36863.1;AAY89587.2;AGS94407.1;O77245.1;AJT60335.1

2.4 EcRXR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖6所示。生長蛻皮時，的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢，蛻皮間期顯著高于蛻皮前期和后期(0.05)，蛻皮前期和后期差異不顯著；生殖蛻皮時，的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢，蛻皮間期顯著低于蛻皮前期和后期(0.05)，蛻皮前期和后期差異不顯著；蛻皮間期時，生長蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)；蛻皮前期和后期時，生長蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

2.5 EcECR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖7所示，生長蛻皮時，的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢，蛻皮間期顯著高于蛻皮前期(0.05)，蛻皮前期顯著高于蛻皮后期(0.05)；生殖蛻皮時，蛻皮前期顯著高于蛻皮間期和后期(0.05)，蛻皮間期與后期差異不顯著；間期時，生長蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)；前期和后期時，生長蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

圖4 脊尾白蝦與其他物種的E75蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

標(biāo)尺長度表明每個位點發(fā)生0.05次置換

The length of the ruler indicates 0.05 replacements at each site

圖5 EcE75基因在不同組織中的表達(dá)

不同字母代表組織間差異顯著(0.05)

Different letters mean significant difference among tissues at 0.05 level

圖6 EcRXR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

同種蛻皮的不同分期用大寫字母表示差異顯著(0.05)，不同種蛻皮的同一分期用小寫字母表示差異顯著(0.05)。下同

Capital letters indicate significant difference among different stages of the same type of molting, while lower case letters indicate significant difference between different types of molting in the same stages. The same as below

圖7 EcECR基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

2.6 EcE75基因在不同蛻皮分期的表達(dá)分析

基因在不同蛻皮分期的脊尾白蝦眼柄中的表達(dá)情況如圖8所示。的表達(dá)量在生長蛻皮時，蛻皮后期顯著低于蛻皮間期和前期(0.05)，蛻皮間期和前期差異不顯著；生殖蛻皮時，蛻皮前期顯著高于蛻皮間期和后期(0.05)，蛻皮間期與后期差異不顯著；蛻皮間期和后期時，生長蛻皮顯著高于生殖蛻皮(0.05)，前期時，生長蛻皮顯著低于生殖蛻皮(0.05)。

圖8 EcE75基因在不同蛻皮分期的表達(dá)

3 討論

本研究首次克隆得到脊尾白蝦的基因，該基因全長為3944 bp，包括2520 bp的開放閱讀框(ORF)，該開放閱讀框編碼839個氨基酸。基因編碼的蛋白包含1個C4鋅指結(jié)構(gòu)、1個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及 6個低組分復(fù)雜區(qū)域。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，克隆得到的基因具有E75基因典型的結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，脊尾白蝦E75在進(jìn)化上具有一定的保守性，與甲殼動物聚為一支，與三疣梭子蟹、黑背地蟹、凡納濱對蝦、中國明對蝦等親緣關(guān)系最近，表明本研究克隆得到的基因確定為脊尾白蝦基因?；蛟诩刮舶孜r的13種組織中均有表達(dá)，其中，眼柄的表達(dá)量最高，卵巢次之。不同物種的組織表達(dá)量有差異，如凡納濱對蝦肌肉中表達(dá)量最高，眼柄次之(錢昭英, 2014)；三疣梭子蟹眼柄中表達(dá)量最高，表皮次之(Xi, 2016)。而脊尾白蝦基因在眼柄和卵巢中的高表達(dá)，暗示其可能與蛻皮及卵巢發(fā)育相關(guān)，需要進(jìn)一步進(jìn)行功能驗證。

眼柄對于甲殼動物蛻皮調(diào)控具有重要作用，且和基因在眼柄中都具有高的表達(dá)量，因此，本研究檢測了不同蛻皮分期和的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，與的表達(dá)規(guī)律基本一致，生殖蛻皮的蛻皮前期和后期表達(dá)量都比生長蛻皮高。Lachaise等(1981)和Chan(1995)研究表明，在卵巢的發(fā)育過程中，隨著卵巢的逐漸成熟，蛻皮激素的濃度隨之增加，在產(chǎn)卵前下降，而蛻皮激素的活性形式20E需要結(jié)合ECR和RXR形成的二聚體，從而導(dǎo)致和表達(dá)量升高。在生殖蛻皮的蛻皮后期表達(dá)量高于蛻皮前期，這與Durica等(1996)的研究結(jié)果相似，推測可能與卵巢發(fā)育有關(guān)?；蛟谏惩懫さ谋磉_(dá)規(guī)律與一致，而生長蛻皮前期，表達(dá)量與蛻皮間期表達(dá)量差異不顯著，與和的表達(dá)規(guī)律不一致，原因有待進(jìn)一步研究。生長蛻皮與生殖蛻皮的主要區(qū)別在于生殖蛻皮伴隨卵巢發(fā)育，而本研究中，相較于生長蛻皮，、和在生殖蛻皮的高表達(dá)，說明其可能與脊尾白蝦的卵巢發(fā)育有關(guān)。通過對脊尾白蝦、和基因在不同蛻皮分期的表達(dá)研究，為蝦蟹類蛻皮機(jī)制及苗種育成提供了參考信息。

Bialecki M, Shilton A, Fichtenberg C,. Loss of the ecdysteroid-inducible E75A orphan nuclear receptor uncouples molting from metamorphosis in. Developmental Cell, 2002, 3(2): 209–220

Chan SM. Cloning of a shrimp () cDNA encoding a nuclear receptor superfamily member: An insect homologue of E75 gene. FEBS Letters, 1998, 436(3): 395– 400

Chan SM. Possible roles of 20-hydroxyecdysone in the control of ovary maturation in the white shrimp, (Crustacea: Decapoda). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 1995, 112(1): 51–59

Crossgrove K, Maina CV, Robinsonrechavi M,. Orthologues of theE75 molting control gene in the filarial parasitesand. Molecular and Biochemical Parasitology, 2008, 157(1): 92– 97

Dubrovsky EB. Hormonal cross talk in insect development. Trends in Endocrinology and Metabolism, 2005, 16(1): 6–11

Durica DS, Hopkins PM. Expression of the genes encoding the ecdysteroid and retinoid receptors in regenerating limb tissues from the fiddler crab,. Gene, 1996, 171(2): 237–241

Gao Y, Zhang X, Wei J,. Whole transcriptome analysis provides insights into molecular mechanisms for molting in. PLoS One, 2015, 10(12): e0144350

Hannas BR, LeBlanc GA. Expression and ecdysteroid responsiveness of the nuclear receptors HR3 and E75 in the crustacean. Molecular and Cellular Endocrinology, 2010, 315(2): 208–218

Kim HW, Lee SG, Mykles DL. Ecdysteroid-responsive genes, RXR and E75, in the tropical land crab,: Differential tissue expression of multiple RXR isoforms generated at three alternative splicing sites in the hinge and ligand-binding domains. Molecular and Cellular Endocrinology, 2005, 242(1–2): 80–95

Lachaise F, Goudeau M, Hetru C,. Ecdysteroids and ovarian development in the shore crab,. Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur Physiologische Chemie, 1981, 362(5): 521–529

Liang JP, Wang Y, Duan YF,. Molecular cloning of ecdysteroid receptor and its expression during the ovarian development and embryogenesis of. Journal of Fisheries of China, 2015, 39(7): 942–952 [梁俊平, 王蕓, 段亞飛, 等. 脊尾白蝦基因的克隆及其在卵巢和胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)分析. 水產(chǎn)學(xué)報, 2015, 39(7): 942–952]

Litoff EJ, Garriott TE, Ginjupalli GK,. Annotation of thenuclear receptors: Comparison to. Gene, 2014, 552(1): 116–125

Liu F, Li J, Li JT,. Cloning and expression of retionid X receptor under temperature and salinity stresses and molting cycles in. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2016, 47(4): 828–837 [柳飛, 李健, 李吉濤, 等. 脊尾白蝦()維甲酸X受體基因克隆及其在溫鹽脅迫和蛻皮周期中的表達(dá)分析. 海洋與湖沼, 2016, 47(4): 828–837]

Priya TAJ, Li FH, Zhang JQ,. Molecular characterization of an ecdysone inducible geneof Chinese shrimpand elucidation of its role in molting by RNA interference. Comparative Biochemistry and Physiology Part B Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 156(3): 149–157

Qian Z, He S, Liu T,. Identification of ecdysteroid signaling late-response genes from different tissues of the Pacific white shrimp,. Comparative Biochemistry and Physiology Part A Molecular and Integrative Physiology, 2014, 172(6): 10–30

Qian ZY. Isolation, identification, expression and function studies of growth performance candidate genes inDoctoral Dissertation of North West Agriculture and Forestry University, 2014 [錢昭英. 凡納濱對蝦生長性能相關(guān)候選基因的分離鑒定、表達(dá)規(guī)律及調(diào)控功能研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2014]

Riddiford LM, Hiruma K, Zhou X,. Insights into the molecular basis of the hormonal control of molting and metamorphosis from, and. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 33(12): 1327–1338

Thummel CS, Chory J. Steroid signaling in plants and insects-common themes, different pathways. Genes and Development, 2002, 16(24): 3113

Verhaegen Y, Parmentier K, Swevers L,The heterodimeric ecdysteroid receptor complex in the brown shrimp: EcR and RXR isoform characteristics and sensitivity towards the marine pollutant tributyltin. General and Comparative Endocrinology, 2011, 172(1): 158–169

Wang ZF. Study on the characteristics of reproduction and molting inMaster′s Thesis of Hebei University, 2014, 22–27 [王戰(zhàn)芳. 中華鋸齒米蝦繁殖及蛻皮特征的研究. 河北大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2014, 22–27]

Xi X, Zhou Y, Liu M,. The nuclear receptor E75 from the swimming crab,: cDNA cloning, transcriptional analysis, and putative roles on expression of ecdysteroid-related genes. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2016, 200: 69–77

Yao TP, Forman BM, Jiang Z,. Functional ecdysone receptor is the product ofandgenes. Nature, 1994, 366(6454): 476–479

Zhang M, Liu P, Li JT,. Cloning and expression of molt-inhibiting hormone gene fromunder environmental stresses. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(4): 764–775 [張美, 劉萍, 李吉濤, 等. 脊尾白蝦蛻皮抑制激素基因全長cDNA的克隆及其對環(huán)境脅迫的響應(yīng). 海洋與湖沼, 2015, 46(4): 764–775]

(編輯 馬璀艷)

Cloning ofGene and Expression Analysis of,andDuring Different Molting Stages of

XU Yang1, WANG Jiajia1, GE Qianqian1, CUI Yanting1, MA Li1, LI Jian1,2①

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Based on the cloning of(, GenBank accession number: KY471317), we studied its role in molting and the expression pattern ofandduring different stages of molting. The full-length cDNA ofis 3944 bp long, which contains an open reading frame (ORF) of 2520 bp. The protein encoded byis composed of 839 amino acids. The estimated mass of the deduced amino acid sequence ofis 92.307 kDa, and the calculated theoretical isoelectric point (pI) is 7.48. The ZnF_C4 and the HOLI domains were detected in, and one distinct transmembrane helix was identified. The geneis conserved during evolution. The phylogenetic tree constructed based on E75 sequences showed that EcE75 was clustered with that of the same clade of crustaceans.has the highest homology with,,,andThe tissue distribution analysis showed thattranscript could be detected in all tested tissuesof,and relatively abundant in eyestalk and ovary. The expression pattern of the genes,, andwas consistent during different stages of molting. At the premoult and postmoult stages, the expression of genes of reproductive molting was significantly higher than that of growth molting. The results showed that there was significant difference between the growth and reproductive molting because of the ovary development. Furthermore, it revealed the effect of ecdysone stimulation on ovarian development through the upregulation of expression of the genes,, and. The present study on the expression of the genes,, andat different stages of molting provides a theoretical basis and a scientific ground for further research on the mechanism of molting.

;;;; Molting stage

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2018)04-0110-09

10.19663/j.issn2095-9869.20170328001

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-48)、泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項目(LJNY2015002)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室鰲山科技創(chuàng)新計劃項目(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-48), Program of Shandong Leading Talent (LNJY2015002), and Science and Technology Innovation Project of Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 許 楊，E-mail: aspenxy@163.com

李 健，研究員，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2017-03-28,

2017-04-28

許楊, 王佳佳, 葛倩倩, 崔彥婷, 馬驪, 李健. 脊尾白蝦基因克隆及、和在不同蛻皮分期的表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 110–118

Xu Y, Wang JJ, Ge QQ, Cui YT, Ma L, Li J. Cloning ofgene and expression analysis of,andduring different molting stages of. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 110–118