蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的腫瘤壞死因子-α基因啟動(dòng)子相關(guān)遺傳易感性分析

嚴(yán)興麗 楊學(xué)麗

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是各種原因引起的血管破裂，聚集在蛛網(wǎng)膜下腔，根據(jù)病因分為自發(fā)性和創(chuàng)傷性出血。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是SAH最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是影響結(jié)局轉(zhuǎn)歸因素之一[1-2]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是參與炎癥反應(yīng)和特異性免疫應(yīng)答的重要因子，既往研究結(jié)果顯示SAH在腦循環(huán)中會(huì)產(chǎn)生大量TNF-α[3-4]。本研究選擇2014年2月-2017年2月就診于本院的168例SAH患者，比較TNF-α啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)位點(diǎn)SNPs，-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣患者中的頻率分布,以探討TNF-α基因相關(guān)遺傳易感性和SAH后CVS的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2014年2月-2017年2月就診于本院的蛛網(wǎng)膜下腔出血患者168例，均經(jīng)過CT或腦脊液檢查確診，并記錄患者的一般臨床資料及Hunt-Hess分級(jí)。經(jīng)顱多普勒和腦血管造影聯(lián)合診斷腦血管痙攣，因?yàn)槭中g(shù)或者介入治療前為腦血管痙攣發(fā)生的高峰期，用經(jīng)顱多普勒測(cè)大腦中動(dòng)脈和大腦前動(dòng)脈的血流速度(Vm)，以最高流速Vm≥120 cm/s診斷為腦血管痙攣，<120 cm/s提示無腦血管痙攣[4-5]。腦血管痙攣組與非腦血管痙攣組各84例，其中腦血管痙攣組男39例，女45例，年齡47.6～67.4歲，平均年齡(55.3±6.5)歲；非腦血管痙攣組男38例，女46例，年齡46.3～66.9歲，平均年齡(54.7±6.1)歲。同期選取84例正常成年人作為對(duì)照組，男40例，女44例，年齡48.1～68.2歲，平均年齡(55.7±6.3)歲，3組性別、年齡等一般資料比較無明顯差異(P>0.05),具有可比性。

1.2 TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)基因型及等位基因頻率分布檢測(cè)

首先，從外周血提取基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和序列特異性引物-PCR(SSP-PCR)方法對(duì)TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)位點(diǎn)(-238G A、-308G A、-857C T、-863C A)[6]進(jìn)行分析，各位點(diǎn)的基本情況見表1。具體操作步驟為(1)對(duì)基因片段進(jìn)PCR擴(kuò)增，25 μL的擴(kuò)增體系(聚合酶、模板基因組DNA、緩沖液、MgCl2、引物、dNTPs)；(2)預(yù)變性及變性(溫度均為94 ℃)；(3)退火：退火溫度30 s；(4)延伸：72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min；(5)鑒定PCR產(chǎn)物：用2%瓊脂糖凝膠電泳15 min，120 V紫外燈下鑒定；其次用特異性限制內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)后消化產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切產(chǎn)物鑒定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CVS相關(guān)臨床資料比較

本研究中由5 個(gè)位點(diǎn)-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C基因型和等位基因頻率為遺傳平衡群體。CVS(+)組與CVS(-)組年齡、性別、高血壓病史及CT Fisher分級(jí)均無明顯差異(P均>0.05)，Hunt-Hess分級(jí)構(gòu)成比有明顯差異(P<0.05)(表2)。

表1 TNF-α啟動(dòng)子區(qū)SNP分型方法

表2 CVS相關(guān)臨床資料

2.2 TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)基因型及等位基因頻率分布

3組-238G/A及-863C/A位點(diǎn)的基因型和等位基因有明顯差異(P<0.05)(表3)。

2.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣發(fā)生的多因素分析

對(duì)相關(guān)臨床資料及多態(tài)性等因素作多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分級(jí)為與腦血管痙攣有關(guān)的危險(xiǎn)因素 (P<0.05)(表4)。

表3 對(duì)照組、CVS(-)組與CVS(+)組-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C多態(tài)性比較

表4 多因素logistic回歸分析

3 討 論

腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血后最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是影響患者致死率和致殘率的主要原因[7]。但是關(guān)于蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)病機(jī)制和原因尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這是由多因素決定的，常見的比如血管活性物質(zhì)、炎癥反應(yīng)因子(如TNF-α)[7-8]。本研究對(duì)TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)的5個(gè)SNPs即-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C與SAH后CVS的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示-238G/A、-863C/A基因型是SAH后發(fā)生CVS的易感因素(P均<0.05)。進(jìn)一步分析顯示-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分級(jí)為與腦血管痙攣有關(guān)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。含SNPs的等位基因特異反應(yīng)元件與反式作用因子的結(jié)合情況決定了SNP對(duì)于細(xì)胞因子的影響情況，其中TNF-α基因-238位在DNA-結(jié)合蛋白與啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)，與啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)，-863位在核因子(NF-κB)結(jié)合序列中，與后者的穩(wěn)定性密切相關(guān)，如果C被A取代，會(huì)影響轉(zhuǎn)錄[9-10]。

TNF-α在體內(nèi)往往通過與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)凋亡通路中的蛋白表達(dá)，影響平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡速度。另外，TNF-α是炎性因子，會(huì)激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，趨使白細(xì)胞等向損傷位置移動(dòng)，破環(huán)血管壁完整性，引起局部血管擴(kuò)張[11]。目前已有研究顯示，TNF-α高表達(dá)更易發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣，這與本研究結(jié)果一致，可能與TNF-α參與血管炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[12]。

尋找蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的易感基因，并篩查易感人群，對(duì)于早期預(yù)防、及時(shí)診斷和治療有著十分重要的意義。本研究結(jié)果顯示-238G/A、-863C/A位點(diǎn)及其基因型是蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的易感基因，但是關(guān)于TNF-α基因?qū)τ谀X血管痙攣的發(fā)病機(jī)制，尚需擴(kuò)大樣本量，采取多中心研究進(jìn)一步探討。