苦參素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖及能量代謝的影響

蔣旗 黃贊松　蘇建偉　曹聰

【摘要】 目的：觀察苦參素（OM）對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)ATP含量、上清液乳酸生成速率的影響，探討其可能的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2，CCK-8法觀察不同濃度、不同作用時(shí)間的OM對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；高效液相色譜技術(shù)、乳酸試劑盒分別檢測(cè)苦參素作用48 h后細(xì)胞內(nèi)ATP、上清液乳酸乳酸生成速率影響。結(jié)果：OM可以抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖，其作用效果隨藥物濃度、作用時(shí)間增加而增強(qiáng)（P<0.05）；不同濃度苦參素作用48 h后細(xì)胞內(nèi)ATP含量、上清液乳酸生成速率顯著下降（P<0.05）。結(jié)論：OM可以抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴性，作用機(jī)制可能是抑制細(xì)胞有氧糖酵解使細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 肝癌細(xì)胞株HepG2； 苦參素； 三磷酸腺苷； 糖酵解

Influence of Oxymatrine on Proliferation and Energy Metabolise of HepG2 Hepatoma Cell/JIANG Qi，HUANG Zansong，SU Jianwei，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（13）：027-030

【Abstract】 Objective：To observe the effects of oxymatrine（OM） on the proliferation、The level of intracellular ATP and Lactic acid concentration in the culture supernatant of HepG2 hepatoma cell，and to disscuss potential mechanism.Method：HepG2 hepatoma cell was cultured in vitro，CCK-8 method was used to detect the proliferation effect at the different concentrations and different times；a high performance liquid chromatography and enzymatic colorimetric method were used to measure the levels of intracellular ATP and the rate of lactic acid concentration growth in the culture supernatant after treating with 48 h oxymatrine respectively.Result：There was significant difference in inhibited effect of OM on the proliferation of HepG2 hepatoma cell，and with the increase of OM concentration and prolonging the time of action， the inhibition effect of OM on the human hepatoma cell line HepG2 was more obvious（P<0.05）.The level of intracellular ATP lower and the rate of Lactic acid concentration growth in the culture supernatant After treating with 48 h OM by the different concentrations（P<0.05）.Conclusion：OM can inhibit the proliferation of HepG2 hepatoma cell，and there is time and dose depended.The mechanism of OM anti-hepatoma may be that through targeting of the glycolytic pathway and results in decreased ATP.

【Key words】 HepG2 hepatoma cell； Oxymatrine； Adenosine triphosphate； Glycolysis

First-authors address：Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.007

有氧糖酵解即“Warburg effect”參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移成為研究的熱點(diǎn)，基于腫瘤細(xì)胞能量代謝為靶點(diǎn)的藥物，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新的突破口[1-3]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明苦參素可能通過(guò)上調(diào)MicoRNA122[4]，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MircoRNA是關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，直接或間接參與癌癥的代謝。因此研究苦參素對(duì)HepG2細(xì)胞能量代謝影響，進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用。目前研究苦參素影響腫瘤細(xì)胞能量較少。本實(shí)驗(yàn)研究苦參素（Oxymatrine或OM）對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)ATP含量影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2人肝癌細(xì)胞株：購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（GFM）、DMEM低糖培養(yǎng)基（GM）：購(gòu)于美國(guó)GIBICO；胰酶-EDTA混合液、RPMI-1640培養(yǎng)液：購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒：購(gòu)于碧云天生物科技；苦參素注射液：購(gòu)于正大天晴藥業(yè)股份有限公司；三磷酸腺苷（ATP）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，HPLC級(jí)；抗霉素-A（AntA）美國(guó)Sigma公司。儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱MCO-18AIC、戴安U3000型液相色譜儀、雷磁PHS-3C PH計(jì)、乳酸測(cè)定試劑盒

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)OM作用HepG2細(xì)胞增殖的影響 分組：實(shí)驗(yàn)組（OM組）、陰性與空白對(duì)照組；取細(xì)胞懸液高倍細(xì)微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，將細(xì)胞密度為5 000個(gè)細(xì)胞/mL接種到96孔中，100 μL/孔。恒溫培育至細(xì)胞貼壁，加入事先配置苦參素培養(yǎng)液，使其最終濃度為由0.5 mg/mL逐倍增加至8 mg/mL，每個(gè)濃度做5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，10 μL/孔，繼續(xù)培育4 h，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度。計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。

1.2.2 HPLC法研究OM對(duì)HepG2細(xì)胞能量代謝的影響 流動(dòng)相：甲醇（99︰1）︰100 mmol/l磷酸鹽緩沖液，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，流速：0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。色譜柱：C18色譜柱（4.6×250 mm，粒徑5 μm）。使用ATP標(biāo)準(zhǔn)品得出色譜圖，同時(shí)應(yīng)用回歸方程建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分組：實(shí)驗(yàn)組（1.0 mg/mL OM）及陰性對(duì)照組（加培養(yǎng)基）；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種到4孔板中，每孔加入細(xì)胞密度1×106/mL。培育細(xì)胞貼壁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 細(xì)胞上清液乳酸含量測(cè)定：加入不含血清的GFM、GM進(jìn)行培養(yǎng)，每孔3 mL，每8小時(shí)抽取100 μL上清液測(cè)定。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組在24 h分別加入或不加入2 μg/mL AntA后每8小時(shí)抽取500 μL上清液測(cè)定。

1.2.2.3 細(xì)胞內(nèi)ATP含量測(cè)定 用PBS水重懸1 mL，取1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，1 500 rpm離心5 min，重懸于0.5 mL預(yù)冷的純凈水，按純凈水與6%三氯乙酸體積1︰1沉淀蛋白，渦旋、離心，條件為（4 ℃低溫、130 000 r/min、10 min）。HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察OM對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將HepG2細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入OM，每24小時(shí)觀察一次，發(fā)現(xiàn)OM對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用隨作用時(shí)間、藥物濃度增加而更加顯著，見(jiàn)圖1、2。

2.2 CCK-8法測(cè)定不同濃度OM作用HepG2細(xì)胞48、72 h增殖抑制的影響 實(shí)驗(yàn)表明OM對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加（P<0.05或者<0.01），見(jiàn)表1。

2.3 乳酸含量測(cè)定 HepG2細(xì)胞經(jīng)1.0 mg/mL IC50OM作用后GM培養(yǎng)基中乳酸增長(zhǎng)的速率下降了3倍，GFM下降1.5倍；HepG2細(xì)胞經(jīng)抗霉素A作用后GM培養(yǎng)基中乳酸增長(zhǎng)的速率增加1.7倍，GFM增加5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.4 細(xì)胞內(nèi)ATP含量測(cè)定 經(jīng)不同濃度苦參作用HepG2細(xì)胞48 h后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ATP含量低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

肝癌發(fā)病率位居于全球第六位[5]。每年有超600 000例被診斷出肝癌，同時(shí)其死亡人數(shù)與其相當(dāng)[6]。超過(guò)四分之三的患者發(fā)生在東亞，其中我國(guó)約占50%[7]。目前原發(fā)性肝癌的治療手段主要為手術(shù)。但約80%肝癌患者在診斷出已屬于中晚期同時(shí)合并有肝硬化失代償期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)[8]。因此目前肝癌的治療仍缺乏有效的手段，常以手術(shù)輔助放、化療等綜合治療為主，但化療毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥，中藥抗腫瘤毒副作用少且有效，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力而受到重視。

苦參素又名氧化苦參堿，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明苦參素有抗癌作用[9-10]，但目前作用機(jī)制仍未能完全闡述。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA是關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，能對(duì)腫瘤細(xì)胞糖、脂肪、氨基酸代謝的關(guān)鍵分子加以調(diào)控，從而直接或間接參與癌癥的代謝[11]。MicroRNA122是肝臟含量最豐富的miRNA，占肝臟miRNA70%，但在肝癌細(xì)胞組織中明顯下調(diào)[12]。多項(xiàng)研究表明MicroRNA122與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[13]。研究表明其能降低肝癌細(xì)胞活力、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)筆者前期實(shí)驗(yàn)表明苦參素可使肝癌細(xì)胞內(nèi)MicroRNA122上調(diào)[4，14]，而MicroRNA122在肝臟代謝中發(fā)揮著重要的作用。丙酮酸激酶（ pyrurate kinase，PK）有兩種亞型M1、M2，PKM2在HCC細(xì)胞有氧糖酵解中起重要作用，為肝癌的生長(zhǎng)增殖提供保障[15]，而Liu等[16]發(fā)現(xiàn)MircoRNA122與PKM2成反比，因此，上調(diào)HHC中的MircoRNA122有可能抑制HHC有氧糖酵解。目前關(guān)于苦參素對(duì)肝癌細(xì)胞能量代謝研究的實(shí)驗(yàn)報(bào)道較少。

王淑靜等[9]研究OM對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞增殖抑制作用，得出當(dāng)藥物濃度達(dá)0.4 mg/mL時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞具有明顯抑制作用，且具有時(shí)間-濃度依賴性。本研究采用CCK-8法發(fā)現(xiàn)藥物濃度達(dá)1 mg/mL以上抑制HepG2細(xì)胞增殖，同時(shí)隨時(shí)間、藥物濃度增加抗腫瘤作用增加，與王淑靜等[9]研究結(jié)果一致。

腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變新陳代謝基因編碼使其利于生長(zhǎng)、生存及增殖，這種代謝改變的共同特點(diǎn)：依賴糖酵解供能，促進(jìn)葡萄糖的攝取、使葡萄糖發(fā)酵為乳酸。這種現(xiàn)象被稱Warburg效應(yīng)。為什么腫瘤細(xì)胞選擇低產(chǎn)能的有氧糖酵解方式一直是科學(xué)家的謎團(tuán)，盡管有氧糖酵解產(chǎn)能效率低下，但腫瘤組織通過(guò)有氧糖酵解的葡萄糖代謝速率更高，這種代謝途徑使得葡萄糖產(chǎn)生乳酸的速率較氧化磷酸化快10～100倍[17]。同時(shí)有氧糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物如：NADH、NADPH，可以作為細(xì)胞增殖的重要原料。在肝癌組織可以利用有氧糖酵解產(chǎn)生的ATP及和中間產(chǎn)物，供其快速生長(zhǎng)[18]。同時(shí)大量乳酸生成，導(dǎo)致酸性微環(huán)境，有利于肝癌細(xì)胞生存[19]。因此，基于腫瘤細(xì)胞能量代謝為靶點(diǎn)的藥物，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新的突破口。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MircoRNA是關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑，直接或間接參與癌癥的代謝。MicoRNA122在肝臟的能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用，筆者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OM能上調(diào)HepG2細(xì)胞MicoRNA122基因[4]，因此使得OM能調(diào)節(jié)HepG2能量代謝成為可能。

胡修明[20]實(shí)驗(yàn)表明苦參素抑制K562腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能抑制細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活性從而阻斷糖酵解途徑。筆者研究中發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞經(jīng)1.0 mg/mL OM作用后乳酸增長(zhǎng)的速率在GM下降了3倍、GFM下降1.5倍（P<0.05），提示苦參素可以抑制糖酵解，使細(xì)胞培養(yǎng)上清液乳酸生成速率下降。同時(shí)HepG2細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度OM作用48 h后，相比陰性對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與前者實(shí)驗(yàn)相吻合[20]。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP含量隨OM濃度增加而逐漸下降，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道抑制腫瘤細(xì)胞ATP合成可抑制細(xì)胞增殖一致。本次研究發(fā)現(xiàn)OM抑制HepG2細(xì)胞增殖與影響腫瘤細(xì)胞能量代謝有關(guān)，表明OM抗腫瘤作用藥理機(jī)制可能通過(guò)影響HepG2細(xì)胞有氧糖酵解。

作為實(shí)驗(yàn)性研究，本實(shí)驗(yàn)仍有較多需進(jìn)一步完善地方如：沒(méi)有檢測(cè)OM對(duì)有氧糖酵解關(guān)鍵酶如丙酮酸激酶活性影響；沒(méi)有進(jìn)一步研究OM作用HepG2細(xì)胞后影響MircoRNA122表達(dá)與有氧糖酵解的關(guān)系。綜上所述，OM能抑制HepG2細(xì)胞增殖，其可能的機(jī)制是抑制細(xì)胞有氧糖酵解使細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] Hanahan D，Weinberg R A.Hallmarks of cancer：the nextgeneration[J].Cell，2011，144（5）：646-674.

[2] Tomita M，Kami K.Systems biology，metabolomics，and cancer metabolism[J].Science，2012，336（6084）：990.

[3] Cairns R A，Harris I S，Mak T W.Regulation of cancer cell metabolism[J].Nature Reviews Cancer，2011，11（2）：85-95.

[4]黃贊松，向發(fā)良，周喜漢，等.苦參素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖和MicroRNA-122、MicroRNA-21表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，34（11）：3079-3081.

[5] Forner A，Llovet J M，Bruix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet，2012，379：1245-1255.

[6] Bruix J，Sherman M，Llovet J M，et al.Clinical management of hepatocellular carcinoma.Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference[J].J Hepatol，2001，35（3）：421-430.

[7] Yim H J，Sang J S，Um S H.Current management of hepatocellular carcinoma： An Eastern perspective[J].World J Gastroenterol，2015，21（13）：3826-3842.

[8]黃贊松，仇儀英，周喜漢.原發(fā)性肝癌現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（24）：4169-4172.

[9]王淑靜，馬琳，孫微微，等.氧化苦參堿對(duì)SGC7901與ECV304的體外活性比較研究[J/OL].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)：1-7[2018-01-07].

[10]閆美俊，劉麗坤.復(fù)方苦參注射液治療晚期消化道腫瘤的臨床觀察[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9（13）：59-61.

[11] Rottiers V，Naeaer A M.MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2012，13（4）：239-250.

[12] Jopling C.Liver-specific microRNA-122：Biogenesis and fanction[J].RNA Biol，2012，9（2）：137-142.

[13] Szabo G，Bala S.MircoRNAs in liver disease[J].Nat Rev Gastro Hepat，2013，10（9）：542-552.

[14]胡靜，周喜漢，胡高裕，等.苦參素聯(lián)合順鉑對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌miR-21、miR-122表達(dá)的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（21）：2084-2087.

[15]秦麒麟，李清龍.miRNA-122與肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)普通外科雜志，2015，24（1）：105-109.

[16] Liu A M，Xu Z，Shek F H，et al.miR-122 Targets Pyruvate Kinase M2 and Affects Metabolism of Hepatocellular Carcinoma[J].PLoS One，2014，9（1）：e86872.

[17] Liberti M V，Locasale J W.The Warburg Effect：How Does it Benefit Cancer Cells？[J].Trends Biochem Sci，2016，41（3）：211-218.

[18] Vander Heiden M G，Cantley L C，Thompson C B.Understanding the Warburg effect：the metabolic requirements of cell proliferation[J].Science，2009，324（5930）：1029-1033.

[19]白小芳，張俊萍.乳酸對(duì)惡性腫瘤生物學(xué)行為的影響[J].中國(guó)癌癥防治雜志，2016，8（6）：401-403.

[20]胡修明.苦參生物堿對(duì)K562細(xì)胞丙酮酸激酶的作用研究[D].廣東：汕頭大學(xué)，2010.

[21] Maher J C，Krishan A，Lampidis T J.Greater cell cycle inhibition and cytotoxicity induced by 2-deoxy-D-glucose in tumor cells treated under hypoxic vs aerobic conditions[J].Cancer Chemother Pharmacol，2004，53（2）：116-122.

（收稿日期：2018-03-13） （本文編輯：周亞杰）