FK1706促進外周神經(jīng)旁路移植術后大鼠神經(jīng)再生的研究

肖毓華　徐杰　李鋆

【摘要】 目的：探究在大鼠神經(jīng)旁路移植術后應用FK1706對促進神經(jīng)再生的作用。方法：SD雄性成年大鼠20只，隨機分成兩組，每組10只，行左坐骨神經(jīng)開窗離斷-自體橈神經(jīng)旁路移植術。實驗組（FK1706組）術后即日開始連續(xù)8周左下肢局部肌注FK1706（0.32 mg/kg），對照組做空白對照。8周后行左側坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測、左腓腸肌肌肉濕重及肌纖維橫截面積測定。結果：8周后，實驗組的CAMP波幅高于對照組，MNCV快于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。實驗組的腓腸肌濕重及肌纖維面積均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩組的近端有髓神經(jīng)纖維數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），實驗組遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)、纖維橫截面積均明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論：大鼠神經(jīng)旁路移植術后應用FK1706能夠移植神經(jīng)再生。

【關鍵詞】 FK1706； 自體神經(jīng)移植； 神經(jīng)再生

Study on Effect of FK1706 to Accelerate Neuroregeneration after Nerve Bypass Grafting Surgery/XIAO Yuhua，XU Jie，LI Jun.//Medical Innovation of China，2018，15（13）：023-026

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of FK1706 to neuroregeneration after nerve bypass grafting.Method：20 adult male SD rats were randomly divided into two groups，10 cases in each group，the left sciatic nerve fenestration and autologous radial nerve bypass grafting was performed.In the experimental group，F(xiàn)K1706（0.32 mg/kg） was injected into the left lower extremities for 8 weeks immediately after the operation，the control group was made blank control.After 8 weeks，the electrophysiological monitoring of the left sciatic nerve，the wet weight of the left gastrocnemius muscle and the cross section of the muscle fiber were measured.Result：After 8 weeks，the amplitude of CAMP in the experimental group was higher than that in the control group，MNCV was faster than that of control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The wet weight and fiber area of gastrocnemius in the experimental group were higher than those in the control group（P<0.05）.There was no significant difference in the number of myelinated nerve fibers between the two groups（P>0.05），the number and cross-sectional area of distal myelinated nerve fibers in the experimental group were significantly better than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The effects of FK1706 to accelerate neuroregeneration after nerve bypass grafting surgery is siginicant.

【Key words】 FK1706； Autogenous nerve transplantation； Neuroregeneration

First-authors address：Fujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.006

神經(jīng)旁路移植術在臨床上可用于治療有神經(jīng)瘤生成的周圍神經(jīng)損傷，該手術方式既保留了神經(jīng)原有的功能，還增加了動力神經(jīng)[1]。實驗報道肯定了神經(jīng)旁路移植術后移植神經(jīng)再生的現(xiàn)象。臨床上周圍神經(jīng)再生速度1～2 mm/d，修復效果欠佳，因此，希望找到一種促進神經(jīng)再生且副作用小的藥物。

已被FDA認證的FK506是一種免疫抑制性藥物[2]。FK506在廣泛應用于器官移植后免疫抑制的領域中發(fā)現(xiàn)其具有促進神經(jīng)生長的作用[3]，但FK506本身對人體組織器官具有強效免疫抑制作用，這大大局限了FK506在神經(jīng)損傷后治療作用。FK1706作為FK506的衍生物在2005年首先被報道[4]，其保留了促神經(jīng)生長的作用，很大程度上弱化了FK506的免疫抑制作用。有文獻報道，F(xiàn)K1706能夠促進軸突再生的基因轉錄和表達[5]。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，肌注FK1706藥物進行干預，以評價其促進神經(jīng)再生的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 FK1706：南京大學實驗室合成；二甲基亞砜（DMSO）：日本sigma-D2650；電子分析天平：Sartorius-BS224S，精度為0.1 mg；透射電子顯微鏡：PHILIPS EM208；光學顯微鏡：Olympus，日本；超薄切片機：Leica UC-6型；游標卡尺：上海量具廠；肌電/誘發(fā)電位儀：Keypoint，美國Medtronic公司；手術顯微鏡：SXP-1B型，上海醫(yī)用光學儀器廠；顯微手術器械：SFZ-967，上海手術器械分廠。藥液配置：電子分析天平準確稱量FK1706粉劑0.056 0 g，充分溶解于56 mL DMSO，移液管移入試劑瓶中，標記為FK1706溶液，存于4 ℃冰箱備用。

1.2 模型制備 腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥鈉

（40 mg/kg）]大鼠后，體位取平臥位，有效固定，備皮消毒鋪巾，取8 mm左側橈神經(jīng)備用。大鼠體位轉變?yōu)楦┡P位，有效固定，在大鼠左大腿做一縱向切口，逐層進入分離組織，見坐骨神經(jīng)。持針鉗于顯微鏡下鉗夾其神經(jīng)干10 s，鏡下確認完全離斷神經(jīng)干，僅有外膜相連。于鉗夾點兩端3 mm處外膜上分別開一1.5 mm直徑的窗口，將自體橈神經(jīng)與兩側窗口行端側吻合，確定無活動性出血后逐層縫合。神經(jīng)旁路移植模型見圖1。

1.3 實驗動物分組與藥物干預 苦味酸標記雄性健康成年SD大鼠20只，200～250 g/只（由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供）。隨機分為實驗組、對照組，每組10只。大鼠由專人飼養(yǎng)，研究過程中對大鼠的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見的要求》[6]。實驗組大鼠左側大腿肌注0.32 mg/kg的FK1706試劑，連續(xù)8周（含術日），1次/d。對照組空白，正常喂養(yǎng)。

1.4 觀察指標 （1）坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測：8周后對大鼠左下肢進行電生理監(jiān)測。行腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥鈉（40 mg/kg）]后，取平臥位，固定后術區(qū)消毒鋪巾，逐層進入，暴露坐骨神經(jīng)，分離腓腸肌。記錄電極插入腓腸肌肌腹，接地電極連接大鼠尾部。于坐骨神經(jīng)端側吻合口近端坐骨結節(jié)水平（P點）和遠端神經(jīng)分支處（D點）放置平行電極（兩極間距固定為2 mm），進行重頻電刺激（電流10 mA），記錄復合運動動作電位（CMAP）及其波幅，測量電極間距，計算運動神經(jīng)傳導速度（MNCV）。MNCV=兩次電極間距/動作電位潛伏期差值。電生理監(jiān)測過程中用生理鹽水保持肌肉濕潤，在室溫28 ℃下進行。（2）腓腸肌濕重及肌纖維面積：完整分離大鼠左側腓腸肌，修潔去除表面結構，立即置于電子分析天平上，測量肌肉濕重。稱重后的腓腸肌用10%的福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋，在標本的最大橫徑作5 ?m厚的切片，HE染色后制片。在40倍目鏡、0.70 ?m/象數(shù)下測定肌纖維橫截面積。（3）有髓神經(jīng)纖維數(shù)及截面積：分別于坐骨神經(jīng)兩端吻合口3 mm處取材（2～3 mm）。以10%的福爾馬林固定，制片0.5 ?m后HE染色。在400倍光鏡下，統(tǒng)計有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。在40倍目鏡TJTY-300圖像分析儀、定標值為0.38 ?m/象數(shù)的條件下測量神經(jīng)纖維橫截面積。作1條過視野中心的直線，測定該直線上神經(jīng)纖維的橫截面積。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 麻醉意外死亡2只，及時進行了補充。實驗期間各組大鼠一般情況可。

2.2 兩組坐骨神經(jīng)電生理監(jiān)測結果對比 8周后，實驗組的CAMP波幅高于對照組，MNCV快于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

2.3 兩組腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積對比 8周后，實驗組肌肉濕重（753.54±105.91）mg，重于對照組（598.02±65.02）mg，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.957，P<0.05）。實驗組腓腸肌肌纖維橫截面積（246.55±50.41）μm2，大于對照組的（178.90±33.59）μm2，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.532，P<0.05）。

2.4 兩組有髓神經(jīng)纖維數(shù)與橫截面積比較 兩組的近端有髓神經(jīng)纖維數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；試驗組遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)、神經(jīng)纖維橫截面積明顯大于對照組（P<0.01），見表2。

3 討論

周圍神經(jīng)完全或不完全損傷后，諸多因素影響其功能恢復，例如年齡、損傷類型、程度、平面、修復時機、手段及康復訓練等[7-8]。影響因素中最重要的是神經(jīng)損傷到行神經(jīng)修復的時間。由于神經(jīng)損傷，肌肉失去神經(jīng)支配，去神經(jīng)化超過一定的時間后，運動終板功能將不可逆破壞及導致不同程度的肌肉萎縮[8]。Sunderland等[9]報道肌肉去神經(jīng)化時間長短與神經(jīng)肌肉功能恢復程度相關。目前臨床上治療周圍神經(jīng)損傷普遍采用神經(jīng)修復、神經(jīng)移植和應用促神經(jīng)生長藥物等[10-11]。但由于神經(jīng)再生速度緩慢[8，12]，如何加快神經(jīng)再生速度及修復其結構成為臨床研究的熱點。

目前治療周圍神經(jīng)損傷常用的方法是自體神經(jīng)端端吻合和端側吻合移植[13]。文獻[14-16]分別在治療面癱和實驗研究中驗證了神經(jīng)端側吻合具有一定應用前景。本實驗采用的移植方法略不同于普通的端側吻合，動力神經(jīng)取自游離的自體橈神經(jīng)，損傷神經(jīng)與動力神經(jīng)兩端進行端側吻合。旁路神經(jīng)移植術后應用FK1706試劑，明顯改善了損傷的神經(jīng)的結構和再生修復。

FK1706是FK506的衍生物，F(xiàn)K506可以表現(xiàn)出長期的加速神經(jīng)生長、再生的作用[17]，但具有強效免疫抑制作用。Price等[18]通過實驗改變FK506的效應區(qū)，合成了FK1706，保留了FK506促進神經(jīng)再生作用的同時，極大的減弱了免疫抑制作用，使之具有良好的應用前景。文獻[19]報道，F(xiàn)K1706促進神經(jīng)生長可能是通過與FKBP-52結合并激活MAPK信號傳導通路，刺激神經(jīng)生長因子（NGF）介導的軸突生長來實現(xiàn)的。FK1706不僅呈現(xiàn)劑量依賴性的促進神經(jīng)再生作用，還具有良好的治療窗。Yamaji等[19]通過實驗發(fā)現(xiàn)對于脊髓受損的大鼠，延遲1周后進行FK1706干預，仍然能夠促進神經(jīng)再生。FK1706的治療時間窗迎合了臨床治療的需要。

本實驗觀察到8周后實驗組CMAP的波幅、MNCV傳導速度、腓腸肌濕重截面積、遠端有髓神經(jīng)纖維數(shù)均優(yōu)于對照組（P<0.05），這表明實驗組對改善神經(jīng)損傷程度明顯優(yōu)于對照組。

在實驗對象的選擇上，本研究考慮到性激素對神經(jīng)再生會產(chǎn)生影響，故全部采用了成年健康雄性SD大鼠，消除實驗干擾。Koeing對黃體酮和雌雄性大鼠的建模支持這觀點[20-22]。

在實驗模型的選擇上，大鼠坐骨神經(jīng)干較粗且走形于大腿中上1/3部分沒有分支，并且可容易進行顯微操作，因此周圍神經(jīng)損傷和修復的研究常選用此模型[23]。

在評價神經(jīng)損傷后恢復和再生的指標選擇上，電生理和組織學檢查最為常用。電生理監(jiān)測包含波幅和傳導速度等項目。電生理檢查能用于判斷神經(jīng)再生，評價其手術后療效及功能恢復情況。波幅體現(xiàn)出了神經(jīng)纖維的數(shù)目和同步興奮的程度。神經(jīng)纖維較成熟且同步興奮度較高，波形規(guī)則且波幅較大。神經(jīng)傳導速度反映了沖動的傳導能力，當受損神經(jīng)開始修復時，隨著軸突、髓鞘的形成，神經(jīng)傳導速度加快[24]。通過實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組CMAP的波幅更大，MNCV更快，提示FK1706能夠促進神經(jīng)再生。

對神經(jīng)肌肉進行組織學檢查可以直接觀察其的形態(tài)學特征。對肌肉進行HE染色制片，可以觀察基本結構、肌纖維及肌肉的萎縮程度，以此判斷去神經(jīng)化情況。透射電鏡下測量髓鞘的各項參數(shù)，由此可反映出神經(jīng)再生的情況。實驗組神經(jīng)纖維數(shù)、神經(jīng)纖維橫截面積均大于對照組（P<0.05）。因此，筆者推論：FK1706較對照組對神經(jīng)再生有著改善作用。

本實驗研究證實了，F(xiàn)K1706對神經(jīng)旁路移植術后大鼠神經(jīng)CMAP、MNCV、腓腸肌濕重和截面積、有髓神經(jīng)纖維數(shù)、再生髓鞘厚度、再生軸突直徑比具有改善作用，F(xiàn)K1706具有促進神經(jīng)旁路移植術后再生神經(jīng)的作用[25-26]。

感謝福建省立醫(yī)院骨二科在撰寫論文方面的幫助，感謝福建省立醫(yī)院科研科全體老師的關懷，感謝福建醫(yī)科大學動物實驗中心在實驗方面給予的大力支持。

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（收稿日期：2018-01-24） （本文編輯：張爽）