某市區(qū)嬰幼兒腹瀉A組輪狀病毒感染狀況及基因分析*

劉愛玲 劉愛勝 吳 敏

輪狀病毒(rotavirus，RV)是1973年首次由澳大利亞Bishop等科學家所發(fā)現(xiàn)，是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體[1]。RV感染具有普遍性、易感性、易變異及RV血清型多等特點，且不同地區(qū)、不同年份RV流行特征明顯不同，即使同一地區(qū)不同季節(jié)、不同年份RV感染和血清型流行情況也不一樣，甚至同一地區(qū)同一種型別也可能存在多種毒株同時流行[2]。因此，不同地區(qū)、不同年份加強對RV感染和血清型流行特征進行不定時監(jiān)測，對防治RV感染性嬰幼兒腹瀉具有重要意義。本研究對深圳市龍華區(qū)門診腹瀉嬰幼兒的A組RV感染和G血清型、P血清分型情況進行了調(diào)查分析，為防治RV性腹瀉提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年3月在深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院門診就診的1033例腹瀉嬰幼兒的1033份糞便標本，其中男性438例，女性595例；年齡0～5歲，平均年齡(2±2.18)歲。按年齡將其分為＜0.5歲組(125例)、0.5～1歲組(492例)、1～3歲組(305例)和＞3歲組(111例)4組。門診嬰幼兒腹瀉診斷標準：每日大便次數(shù)增加(≥3次)或大便性狀發(fā)生明顯改變(包括稀水樣、蛋花樣、黏液樣或稀糊樣等)[2-3]。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準后實施，并經(jīng)嬰幼兒家長知情同意并簽定知情同意書。

1.2 儀器與試劑

CEQ8800型測序儀及配套試劑由美國Beckman公司提供；瓊脂糖凝膠電泳儀及配套試劑由美國Bio-Rad公司提供；核酸提取試劑盒由美國Qiagen公司提供；RT-聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒由美國Invitrogen公司提供；RV抗原檢測試劑盒由艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司提供。

1.3 檢測方法

(1)標本采集。采集門診腹瀉嬰幼兒急性期糞便，置于無菌容器內(nèi)，立即送至檢驗科用膠體金免疫層析法進行RV抗原檢查，對A組RV陽性的糞便標本用生理鹽水混勻，制成10%的懸液，于-80℃保存，為進行RV的G血清型和P血清型分型備用。

(2)RV抗原檢測。采用膠體金免疫層析法對腹瀉標本中RV抗原進行檢測，操作按試劑盒說明書進行。

(3)RV分型。①RV病毒核酸提取，RV病毒核酸提取嚴格按照試劑盒說明書進行，在提取的80 μl核酸標本中加入RNA酶抑制劑1.5 μl(40 U/μl)，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；②引物選擇，采用套式PCR對RV病毒進行G血清型和P血清型分型。

(4)G血清型分型。一次放大采用編碼VP7基因兩端的保守序列設計引物(正鏈引物9Con1，負鏈引物9Con2)，放大基因的全長序列，二次放大正鏈引物選擇基因的不同血清型的特征設計一組分型引物(9T1、9T2、9T3、9T4、9T9B)，正鏈引物為基因5’端保守序列的公用引物(9Con1)。這樣從放大產(chǎn)物的特征分子量大小即可區(qū)別RV樣品的不同血清型[4]。

(5)P血清型分型。引物設計原理與G血清型分型類似，一次放大引物(4Con3和4Con2)選擇在VP4基因的高保守序列，二次放大負鏈引物選擇一次放大基因區(qū)段內(nèi)不同血清型的特征序列，設計一組分型引物(1T1、2T1、3T1、4T1、5T1)，正鏈引物仍采用5’端的公用引物(4Con3)，引物由美國Invitrogen公司合成[5]。引物序列見表1。

(6)巢式PCR。采用RT-PCR法對提取的核酸進行擴增。反應體系為模板RNA 1 μl，2×Reaction Mix(containing 0.4 mmol/L of each dNTP，3.2 mM MgSO)5 μl，引物0.15 μmol/L，SurperScriptTMⅢ RT/Platium Taq Mix 0.4 μ l， RNase inhibitor0.05 μl，總體積10 μl。

(7)RT-PCR反應。RT-PCR反應條件為50 ℃30 min→94 ℃ 10 min，然后94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→68 ℃2 min，反復循環(huán)35次后于68 ℃延伸5 min。將RTPCR產(chǎn)物稀釋100～10 000倍后進行PCR。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→68 ℃90 s，反復運行25個循環(huán)后于68 ℃延伸7 min。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率(%)表示，組間比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A組RV感染情況

在1033份門診嬰幼兒腹瀉標本中共檢出A組RV抗原436份，陽性率為42.21%(436/1033)，其中男性為44.06%(193/438)，女性為40.84%(243/595)，男性略高于女性，但差異無統(tǒng)計學意義(x2=1.032，P＞0.05)。

2.2 不同年齡嬰幼兒A組RV感染情況

0.5～1 歲組嬰幼兒A組RV感染率最高，陽性率為61.18%，明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計學意義(x2=9.762，P＜0.05)，其次為1～3歲組，陽性率為33.11%，見表2。

表1 A組輪狀病毒G和P分型引物序列情況

表2 不同年齡腹泄嬰幼兒A組RV感染情況

表3 腹泄嬰幼兒A組RV感染季節(jié)分布情況

2.3 A組RV感染季節(jié)分布情況

每年第4季度A組RV感染率最高，陽性率為53.54%，略高于1季度的47.99%，但差異無統(tǒng)計學意義(x2=1.032，P＞0.05)，但明顯高于其他兩個季度，差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.135，x2=5.415；P＜0.05)，見表3。

2.4 A組RV的G血清型分布情況

4 3 6 例R V陽性標本中G 3血清型檢出率最高，為53.21%(232/436)，明顯高于G1血清型的31.42%(137/436)、G2血清型的2.75%(12/436)、G4血清型的2.06%(9/436)和G9血清型的1.61%(7/436)，其差異有統(tǒng)計學意義(x2=3.854，x2=6.751，x2=11.582，x2=19.192；P＜0.05)。不同G血清型混合感染率為4.59%(20/436)，且以混合感染G3G1血清型為主，占55.0%(11/20)。不能確定G血清型有19例，占4.36%。

2.5 A組RV的P血清型分布情況

436例RV陽性標本P[8]血清型檢出率最高，陽性率為79.82%(348/436)株，明顯高于P[1]血清型的5.28%(23/436)、P[4]血清型的2.52%(11/436)、P[9]血清型的1.83%(8/436)及P[6]血清型的1.61%(7/436)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=27.025，x2=31.635，x2=40.924，x2=49.516；P＜0.05)。不同P血清型混合感染率3.90%(17/436)。未知P血清型22株，占5.05%(22/436)。

2.6 A組RV的G血清和P血清型混合感染情況

RV的G和P血清型混合感染主要見于G3P[8]和G1P[8]血清型，陽性率分別為43.58%(190/436)和28.90%(126/436)，其次為G2P[8]血清型和G3G1P[8]血清型。此外，還檢測到其他較少見的混合感染株，見表4。

表4 腹泄嬰幼兒不同RV的G和P血清型混合感染情況

2.7 凝膠電泳分析

取3～8 μl的PCR產(chǎn)物，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(60 min/120 V)，并采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，如圖1、圖2所示。

圖1 輪狀病毒RT-PCR特異性產(chǎn)物電泳圖

圖2 RV PCR陽性產(chǎn)物測序圖

3 討論

隨著抗生素的廣泛應用，以及人們生活水平的提高及衛(wèi)生習慣的改善，細菌性腹瀉得到了有效控制，而病毒性感染成為全球嬰幼兒急性腹瀉的重要原因[6]。RV感染性腹瀉是嬰幼兒常見疾病之一，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉和嘔吐，各個年齡段均有發(fā)生，主要易發(fā)于兒童、老年人、旅游者及免疫受抑制者， 尤其是嬰幼兒，不僅發(fā)病率高，而且是嬰幼兒死亡的主要原因之一，僅次于肺炎排在第2位[7]。2008年據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，RV感染造成約45萬幼嬰兒死亡，其中大約90%RV感染死亡病例發(fā)生在亞洲和非洲，我國每年約4萬嬰幼兒死于RV感染性腹瀉[8-9]。目前，尚無治療RV感染性嬰幼兒腹瀉的特效方法，主要采用對癥治療，糾正脫水和維持電解質(zhì)平衡。因此，監(jiān)控和預防RV感染具有重要意義[10]。

不同地區(qū)和不同年份A組RV感染率差別相差很大，國內(nèi)外大多數(shù)文獻報導A組RV感染率處于31%～68%之間，且不同性別嬰幼兒之間感染率差異不大。本研究結(jié)果顯示，2016年1月至2017年3月深圳龍華區(qū)門診腹瀉嬰幼兒A組RV感染率為42.21%，明顯低于王瓊等[11]報導2007-2009年深圳地區(qū)的52.5%，而明顯高于徐丹等[12]報導2010-2013年深圳南山區(qū)的30.35%和盧麗娟等[13]報導2008-2011年上海地區(qū)的36.0%，這可能與不同地區(qū)和年份研究嬰幼兒年齡大小、檢測方法、生活水平、接種疫苗、預防知識宣傳及標本收集的季節(jié)性等原因存在很大差異有關。且不同性別嬰幼兒RV感染率之間差異無統(tǒng)計學意義，這可能與該年齡的嬰幼兒免疫力、生活方式及基礎生理等因素相差不大有關。

本研究結(jié)果顯示，A組RV好發(fā)0.5～1歲組，其感染率明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計學意義，與國內(nèi)外大部分研究結(jié)果相一致[4-14]。這可能與此時嬰幼兒從母體獲得被動免疫能力逐漸消耗完，而自體主動免疫尚未完全成熟，對各種病原感染的特異性IgM抗體產(chǎn)生不足等有關外，還與該年齡段嬰幼兒已經(jīng)添加輔食，人工喂養(yǎng)，腸道局部分泌型IgA(sIgA)減少，較易感染各類病原體等有關。＜6個月的嬰幼兒感染率較低，這可能與該年齡段的嬰兒大多處于母乳喂養(yǎng)期，乳汁中大量sIgA可以起到保護其腸道黏膜的作用及從母體獲得被動免疫能力尚在等因素有關。2歲以上的嬰幼兒RV感染率逐漸下降，這可能與嬰幼兒自身sIgA增高、自體主動免疫逐漸成熟及抵抗力逐漸增強等因素有關。因此，加強飲食和環(huán)境衛(wèi)生、切斷傳播途徑、提高兒童主動免疫水平是預防RV感染性嬰幼兒腹瀉重要環(huán)節(jié)。

目前，全球全年均可發(fā)生RV感染，但發(fā)病高峰多為溫帶地區(qū)的秋冬季節(jié)，具有明顯的季節(jié)性，與溫度變化有密切關系[15]。本研究結(jié)果顯示，A組RV好發(fā)于每年的第4季度和第1季度，明顯高于其他兩個季度，與國內(nèi)外大部分文獻報導相一致[15-16]。這可能與第4季度和第1季度天氣寒冷、溫差大、嬰幼兒容易著涼及寒冷干燥天氣有利于A組RV生長繁殖等因素有關。

A組RV的外衣殼蛋白VP4和VP7基因，具有型特異性抗原決定簇，可誘導機體發(fā)生免疫應答產(chǎn)生特異性中和抗體，同時也作為RV血清基因型的分型依據(jù)。根據(jù)A組RV的VP7和VP4核酸序列差異可分為27種G基因型和35種P基因型，且G和P血清型可自由組合形成混合感染[11]。因此，不同地區(qū)、不同年份A組RV的G和P型別及組合均可能不一致，形成RV復雜多變的分子流行特征。本研究結(jié)果顯示，2016年1月至2017年3月A組RV的G血清型以G3和G1感染為主，陽性率分別為53.21%和31.42%，而P血清型以P[8]感染為主，陽性率為79.82%，其次為P[1]型，陽性率為5.28%，與有關文獻報導相一致[11-16]。但混合感染類型較上述文獻報導的要復雜一些，產(chǎn)生了3種甚至4種血清型混合感染，主要以G3P[8]和G1P[8]為主，陽性率分別為43.58%和28.90%，其次為G2P[8]和G3G1P[8]，這可能與A組RV治療藥物和口服疫苗的不斷使用，導致A組RV不斷發(fā)生變異有關。

A組RV是門診嬰幼兒腹瀉主要病原體之一，好發(fā)于每年第4季度和第1季度的0.5～1歲嬰幼兒，且血清型混合感染類型越來越復雜。目前缺乏針對RV感染的特效藥物，接種RV疫苗是預防RV感染最有效方法，但不同血清型之間缺乏有效的交叉保護作用，不同地區(qū)、不同年份A組RV感染率及血清型流行具有很大差異性，并不斷出現(xiàn)一些新流行毒株，在一定程度地妨礙了接種RV疫苗的效果[17]。因此，不同地區(qū)或同一地區(qū)不同年份對A組RV感染和血清型流行情況進行不定時監(jiān)測，對防治RV感染及疫苗的改進和推廣具有重要的意義。