心肌梗死小鼠microRNAs表達(dá)及干預(yù)后心功能變化的研究

魏麗萍，齊新，孫旭森，張宇凡

心力衰竭（heart failure，HF）是各種危重心血管疾病發(fā)展的終末階段，HF確診患者5年生存率僅為50%，被認(rèn)為是危害人類健康的主要疾病之一[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者普遍認(rèn)為，HF的本質(zhì)是一種分子?臨床綜合征，基因表達(dá)調(diào)控異常與HF的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2]。心臟的病理生理變化與維持心功能的基因表達(dá)譜有關(guān)，而微小RNA（miRNAs）則是基因表達(dá)的重要調(diào)控者[3]。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，主要作用是通過(guò)誘導(dǎo)靶基因沉默參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控[3?4]，特定miRNA的表達(dá)模式很大程度上取決于組織和細(xì)胞類型、代謝情況以及疾病狀態(tài)。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可能在心力衰竭進(jìn)展中起著上游調(diào)控的作用[4?6]。表觀遺傳學(xué)研究表明，miRNAs參與心力衰竭的多個(gè)基本病理過(guò)程，如心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、心肌肥厚和心臟重構(gòu)等[5?6]。本研究通過(guò)建立C57BL/6 小鼠心肌梗死模型，檢測(cè)不同時(shí)間miRNA?1及miRNA?21的表達(dá)變化，同時(shí)觀察miRNA?1沉默及過(guò)表達(dá)miRNA?21后小鼠心肌功能及結(jié)構(gòu)變化，旨在了解miRNAs的表達(dá)和心肌重構(gòu)及心功能變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雄性C57BL/6清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。人工設(shè)計(jì)合成的miRNA?1阻斷劑（Antagomir，用于沉默目標(biāo)miRNA）、慢病毒（lentiviral）載體pPS?EF1?copGFP?LCS（報(bào)告基因?yàn)镚FP，用于過(guò)表達(dá)目標(biāo)miRNA）均購(gòu)自上海吉瑪生物制劑公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型制備 小鼠用2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，剪開(kāi)左側(cè)胸骨，暴露冠狀動(dòng)脈，用6–0號(hào)絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支中段，之后關(guān)胸，等待麻醉蘇醒后放入飼養(yǎng)籠內(nèi)。假手術(shù)組給予同樣的外科術(shù)式，但不結(jié)扎前降支中段。因手術(shù)時(shí)間短，建立了無(wú)需機(jī)械通氣，麻醉后快速?gòu)?fù)蘇的手術(shù)方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率高，模型成功率達(dá)80%。72只小鼠建模成功后1周按隨機(jī)數(shù)字表法分為心肌梗死組（MI組），miRNA?1干預(yù)組（干預(yù)1組）及miRNA?21干預(yù)組（干預(yù)2組），每組24只，每個(gè)觀察時(shí)間段6只，另有假手術(shù)組6只，用于收集各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)（0周數(shù)據(jù)）。干預(yù)1組于心肌梗死區(qū)及周邊組織注射人工合成的 miRNA?1 Antagomir（1×109TU/mL）來(lái)阻斷miRNA?1表達(dá)，注射劑量為30 μL。干預(yù)2組先從基因組中擴(kuò)增miRNA?21，然后將其克隆入pPS?EF1?copGFP?LCS，注射劑量為30 μL，1×109TU/mL，于制備心肌梗死模型時(shí)結(jié)扎左前降支后在心肌內(nèi)多點(diǎn)注射以感染心肌細(xì)胞，使miRNA?21基因過(guò)表達(dá)，觀察功能效應(yīng)。各組于4、8、12及16周后進(jìn)行心臟超聲檢查，檢查后處死動(dòng)物，獲取心肌梗死區(qū)及心肌梗死周邊區(qū)組織進(jìn)行miRNAs測(cè)定。

1.2.2 心功能各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè) Vevo 770 high resolution system超聲儀檢測(cè)心肌梗死模型成功后4、8、12及16周左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室心肌質(zhì)量（LVMass）等心功能指標(biāo)，評(píng)估心室重構(gòu)程度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)miRNAs基因表達(dá) （1）miRNA?1上游：5′?CGTGGTGAGCAAGTATGTAAAA?3′，miRNA?21上游：5′?CCTTAGGCAGACTGATGTTGAAAA?3′，內(nèi)參對(duì)照為U6。（2）組織RNA的提?。喝∵m量組織至1.5 mL EP管中，用剪刀剪碎組織后加Trizol 1 mL后用玻璃棒研磨，充分震蕩均勻，按照常規(guī)方法提取溶解RNA，?80℃保存?zhèn)溆谩Ｖ筮M(jìn)行純度檢測(cè)和總RNA完整性檢測(cè)。（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取RNA模板4 μL，引物miRNA?1、miRNA?21、U6各1 μL，5×ScriptTM緩沖液1 μL，ScriptTMRT酶MixⅠ 1 μL，加去RNA水至總體積20 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃水浴箱中2 h，待轉(zhuǎn)錄結(jié)束后再置于95℃金屬浴中5 min，然后立即置于冰盒上。（4）熒光定量PCR反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 2 μL，SYBR Premix Dimer Eraser（2×）10 μL，20×引物各1 μL、加水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min；變性85 ℃ 5 min，退火 53 ℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)。熒光定量 PCR 和 2－ΔΔCt法分析miRNA?1、miRNA?21基因相對(duì)表達(dá)量：其中，ΔCt=Ct目的基因?Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組?ΔCt對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD?t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶基因表達(dá)的改變對(duì)心肌梗死小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

2.1.1 miRNA?1在MI組及干預(yù)1組表達(dá)的比較 2組miRNA?1的表達(dá)量在梗死4周時(shí)即升高，8周時(shí)繼續(xù)保持升高，12周時(shí)表達(dá)最高，至16周時(shí)仍呈高表達(dá)狀態(tài)。干預(yù)1組建模后4、8、12和16周miRNA?1表達(dá)量均低于MI組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.1.2 miRNA?21在MI組及干預(yù)2組中表達(dá)水平的比較 miRNA?21在MI組心肌梗死后4周表達(dá)略升高，后于8、12、16周呈降低趨勢(shì)，而干預(yù)2組4周時(shí)高于0周，在8、12、16周miRNA?21表達(dá)高于0周，且均高于MI組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.2 不同時(shí)段各組超聲指標(biāo)比較 MI組心肌梗死后4周可出現(xiàn)左室前壁部分室壁厚度明顯變薄，左室短軸切面顯示左室前壁、前間壁心肌結(jié)構(gòu)消失。隨后8～16周隨心肌梗死時(shí)間延長(zhǎng)，心肌回聲增強(qiáng)，室壁變薄，運(yùn)動(dòng)幅度逐漸減弱或消失。隨著心肌梗死的進(jìn)展，LVDD擴(kuò)大，心室發(fā)生重構(gòu)，LVmass增加，LVEF逐漸降低。干預(yù)1組心肌梗死8周和12周時(shí)LVDD小于MI組，8、12、16周時(shí)LVEF大于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。干預(yù)2組心肌梗死12周時(shí)LVDD小于MI組，12周和16周時(shí)LVEF大于MI組，心肌梗死12周時(shí)LVMass小于MI組，見(jiàn)圖2。干預(yù)組12周時(shí)心肌回聲增加趨勢(shì)較MI組均有減弱，見(jiàn)圖3。

Tab.1 Comparison of the expression of miRNA-1 in myocardium between MI group and miRNA-1 antagomir group表1 miRNA-1在MI組及干預(yù)1組表達(dá)的比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the expression of miRNA-1 in myocardium between MI group and miRNA-1 antagomir group表1 miRNA-1在MI組及干預(yù)1組表達(dá)的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與同組0周比較，P＜0.05；表2同

組別MI組干預(yù)1組t 0周1.12±0.15 1.12±0.15?4周16.19±1.87a 6.89±0.68a 11.485＊＊8周17.78±2.02a 8.93±0.89a 9.803＊＊12周28.58±2.15a 14.63±1.67a 12.554＊＊16周25.18±2.50a 12.16±1.07a 11.739＊＊F 183.710＊＊155.146＊＊

Tab.2 Comparison of the expression of miRNA-21 in myocardium between MI group and miRNA-21 lentiviral group表2 miRNA-21在MI組及干預(yù)2組心肌組織表達(dá)的比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the expression of miRNA-21 in myocardium between MI group and miRNA-21 lentiviral group表2 miRNA-21在MI組及干預(yù)2組心肌組織表達(dá)的比較 （n=6，±s）

組別0周4周8周12周16周F MI組干預(yù)2組t 1.07±0.14 1.07±0.14?3.54±0.22a 1.96±0.24a 11.959＊＊0.46±0.21a 2.09±0.21a 13.224＊＊0.45±0.18a 2.09±0.22a 14.401＊＊0.34±0.20a 2.27±0.24a 15.400＊＊303.844＊＊30.227＊＊

Fig.1 Comparison of ultrasound indicators between MI group and intervention group 1 at different time points圖1 不同時(shí)段MI組與干預(yù)1組超聲指標(biāo)比較

3 討論

心臟的病理生理變化與維持心功能的基因表達(dá)譜有關(guān)，miRNAs是基因表達(dá)變化的重要調(diào)控者。miRNAs可能在心力衰竭病程進(jìn)展中起著上游調(diào)控的作用[7?8]。心肌細(xì)胞中分布最廣泛且與心臟發(fā)育有關(guān)的microRNA是miRNA?1，miRNA?1是由兩個(gè)幾乎完全相同的基因（miRNA?1和miRNA?1?1）編碼，位于E3?泛素?蛋白連接酶的內(nèi)部[9]。心肌細(xì)胞凋亡與miRNA?1的異常表達(dá)密切相關(guān)，miRNA?1基因缺失的動(dòng)物將會(huì)出現(xiàn)各種心臟異常。Tang等[10]發(fā)現(xiàn)miRNA?1的過(guò)表達(dá)加重了H2O2誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡，而使用寡核甘酸抑制miRNA?1表達(dá)后，心肌細(xì)胞對(duì)H2O2產(chǎn)生了耐藥性。Glass 等[11]將miRNA?1胚胎干細(xì)胞（miRNA?1?1?ES）移植到c7BL/6小鼠前降支結(jié)扎后心肌梗死邊緣區(qū)域，發(fā)現(xiàn)miRNA?1?1?ES可抑制宿主心肌細(xì)胞梗死過(guò)程中p?AKT通路激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，心臟功能得到了顯著改善。Cheng等[12]發(fā)現(xiàn)血清miRNA?1在心肌梗死后迅速增加，在6 h達(dá)到峰值，并在第3天恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，血清miRNA?1水平和心肌梗死面積呈正相關(guān)。Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)miRNA?1基因敲除可以導(dǎo)致小鼠心臟電傳導(dǎo)、細(xì)胞周期和一系列的生物效應(yīng)變化。Lu等[14]研究顯示，miRNA?1參與調(diào)節(jié)心臟衰竭和心律失常，普萘洛爾可降低心肌梗死后高表達(dá)的miRNA?1，抑制炎癥應(yīng)答因子表達(dá)。

Fig.2 Comparison of ultrasound indicators between MI group and intervention group 2 at different time points圖2 不同時(shí)段MI與干預(yù)2組超聲指標(biāo)比較

成體心臟對(duì)于損傷及過(guò)負(fù)荷的反應(yīng)為激活不同系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基因調(diào)控因子，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、胚胎基因表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。miRNA?21調(diào)控ERK?MAP信號(hào)系統(tǒng)可影響心臟結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致左室擴(kuò)大，進(jìn)展性的心肌纖維化，心力衰竭及心律失常[15]。miRNA?21是公認(rèn)的調(diào)控心臟發(fā)育，可使胚胎基因在心肌細(xì)胞中激活的一類miRNAs，但miRNA?21在心肌纖維化中的作用，研究結(jié)果并不一致。Cheng等[16]報(bào)道寡核苷酸介導(dǎo)miRNA?21基因沉默后可抑制心肌細(xì)胞增殖。而Tatsuguchi等[17]報(bào)道m(xù)iRNA?21基因敲除可加重心肌纖維化。但值得注意的是，無(wú)論是正性作用還是負(fù)性作用，miRNA?21均可調(diào)控細(xì)胞增殖，抑制凋亡。Dong等[18]報(bào)道心肌梗死早期miRNA?21在心肌梗死區(qū)域是低表達(dá)的，miRNA?21具有一定程度的抗凋亡作用。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA?1、miRNA?29、miRNA?30、miRNA?133及miRNA?150是在心力衰竭中表達(dá)上調(diào) ，而 miRNA?21、miRNA?23a、miRNA?125、miRNA?195、miRNA?199及 miRNA?214在心力衰竭、心肌纖維化中表達(dá)下調(diào)[19]。

Fig.3 Comparison of ultrasonic images in 12 weeks between intervention group and un?intervention group圖3 12周時(shí)干預(yù)后與未干預(yù)組比較

本研究關(guān)注了在心臟廣泛分布的兩種miRNAs，即miRNA?1和miRNA?21[8，20]，觀察心肌梗死后不同時(shí)期兩種miRNAs的表達(dá)情況，并分別給予經(jīng)典的基因沉默和過(guò)表達(dá)干預(yù)后觀察兩種miRNAs的表達(dá)及心肌功能、心室重構(gòu)情況的變化。結(jié)果表明，MI組miRNA?1的表達(dá)量在梗死4周時(shí)即升高，12周時(shí)表達(dá)最高，至16周時(shí)仍呈高表達(dá)狀態(tài)，而阻斷miRNA?1表達(dá)后，miRNA?1表達(dá)明顯降低。miRNA?21在心肌梗死后4周表達(dá)略升高，后于8、12、16周明顯降低，而應(yīng)用慢病毒載體過(guò)表達(dá)miRNA?21后，各時(shí)段miRNA?21表達(dá)明顯升高。心肌功能觀察發(fā)現(xiàn)模型小鼠心肌梗死后4周可出現(xiàn)左室前壁部分室壁厚度明顯變薄，左室短軸切面顯示左室前壁、前間壁心肌結(jié)構(gòu)消失，隨后觀察8周、12周、16周時(shí)心肌結(jié)構(gòu)改變明顯，心肌回聲增強(qiáng)，室壁變薄，運(yùn)動(dòng)幅度減弱或消失。沉默miRNA?1表達(dá)后，于心肌梗死8周及12周時(shí)大鼠LVDD較MI組縮小，而過(guò)表達(dá)miRNA?21后，于心肌梗死12周時(shí)LVDD也較MI組縮小，同時(shí)LVEF于12周及16周時(shí)較MI組有明顯改善，LVmass于心肌梗死12周時(shí)可見(jiàn)降低。心肌回聲增加趨勢(shì)較MI組不同時(shí)段均有減弱。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，心肌梗死發(fā)生過(guò)程中，miRNA?1及miRNA?21在不同時(shí)間表達(dá)是變化的，給予相應(yīng)干預(yù)后心功能及心室重構(gòu)情況較未干預(yù)組在不同時(shí)間有所改善，結(jié)合既往研究，筆者推測(cè)miRNA?1及miRNA?21參與心力衰竭的多個(gè)基本病理過(guò)程，如心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化和心臟重構(gòu)等過(guò)程。miRNA?1和miRNA?21可能在早期心力衰竭、心室重構(gòu)及心肌纖維化調(diào)控的過(guò)程中起到更為重要的作用。