神經(jīng)干細(xì)胞提取及培養(yǎng)方法的體會(huì)

吳增，董賢慧，李媛，靳曉飛，周曉紅，高維娟△

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細(xì)胞，具有自我更新與分化的能力，通過(guò)對(duì)稱性分裂產(chǎn)生兩個(gè)完全相同的NSCs，通過(guò)非對(duì)稱性分裂分化為其他細(xì)胞（神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）。NSCs作為一種特殊的干細(xì)胞，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性（分化性、遷移性、趨化性和低免疫原性），因此NSCs移植在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有良好前景。開(kāi)展NSCs移植的前提是獲得活力和穩(wěn)定性均較高的種子細(xì)胞，而NSCs較其他細(xì)胞更加脆弱，對(duì)外界環(huán)境的變化非常敏感，所以提取NSCs的技術(shù)操作應(yīng)十分精細(xì)，并全面把控體外培養(yǎng)NSCs的影響因素?；谥T多研究者的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，本課題組經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐，篩選并建立了一套完善、實(shí)用、可靠的NSCs提取及體外培養(yǎng)方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 主要材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD孕鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016?0011。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：DMEM/F?12（1∶1）、B?27、Accutase酶均購(gòu)于Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）均購(gòu)于PeproTect公司；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：3111型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo公司；SW?CJ?2FDSW?CJ?2FD潔凈工作臺(tái)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IX73型生物顯微鏡購(gòu)于OLYMPUS公司；H2050R型離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

2 神經(jīng)干細(xì)胞的提取

2.1 提取步驟 取孕14 d SD大鼠1只，麻醉后將其浸泡于75%乙醇中0.5 h（僅露出頭部），然后用無(wú)菌器械取出子宮，將子宮置于75%乙醇中浸泡2 min。在潔凈工作臺(tái)內(nèi)解剖子宮，將胎鼠置于預(yù)冷的D?Hank’s液中，迅速取出胎鼠雙側(cè)大腦皮質(zhì)，置于含有D?Hank’s液的培養(yǎng)皿中，迅速用鑷子仔細(xì)剝除腦膜，轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，眼科剪剪碎，用無(wú)菌吸管轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以10～12次/min的頻率緩慢輕柔吹打含有腦組織的培養(yǎng)基（機(jī)械吹打法），吹打至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織塊，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入NSCs無(wú)血清培養(yǎng)基，輕柔吹打成細(xì)胞懸液，先后過(guò)200目和500目細(xì)胞篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×106個(gè)/mL密度接種，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，見(jiàn)圖1。

Fig.1 A good condition of the neurospheres(×400)圖1 狀態(tài)良好的神經(jīng)球（×400）

2.2 提取要點(diǎn)

2.2.1 鼠齡的選擇 大鼠的NSCs于胚胎第12天開(kāi)始出現(xiàn)，第14～15天達(dá)到高峰[1?3]。

2.2.2 無(wú)菌操作 原代細(xì)胞提取過(guò)程中保持無(wú)菌原則至關(guān)重要，且NSCs較其他細(xì)胞更脆弱，因此更需注意無(wú)菌操作。主要環(huán)節(jié)：保持操作環(huán)境無(wú)菌，取材室和細(xì)胞室紫外線消毒20 min；操作人員嚴(yán)格消毒程序，換滅菌鞋、換無(wú)菌衣、戴口罩、戴帽子、洗手、穿無(wú)菌手術(shù)衣；通過(guò)乙醇浸泡和紫外線照射兩種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行徹底滅菌；對(duì)所有取材器械進(jìn)行高壓滅菌。

2.2.3 低溫與營(yíng)養(yǎng)支持 在提取過(guò)程中，應(yīng)保持NSCs處于低溫環(huán)境并給予營(yíng)養(yǎng)支持。低溫是活體組織和離體細(xì)胞長(zhǎng)期保存的一種有效方法，主要通過(guò)降低細(xì)胞代謝率來(lái)起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)操作全程在冰板上進(jìn)行，D?Hank’s液預(yù)冷，使腦組織處于低溫環(huán)境中，可以最大限度提高細(xì)胞的存活率。為保證細(xì)胞的存活率，在D?Hank’s液中剝除腦膜后應(yīng)立即將腦組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，接種前便給予營(yíng)養(yǎng)支持。

2.2.4 細(xì)胞分離方法 原代細(xì)胞分離常采用機(jī)械吹打和胰酶消化兩種方法。機(jī)械吹打法即提取步驟中所提及的方法。胰酶消化法：用無(wú)菌吸管將剪碎的大腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，靜置2 min，去上清，加入1 mL 0.125%胰酶，消化10 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，去上清，加入培養(yǎng)基，輕柔吹打成細(xì)胞懸液，過(guò)細(xì)胞篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種。胰酶消化的時(shí)間很難控制，如果消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致消化后活細(xì)胞比例較低；胎鼠腦組織中細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織均較少，細(xì)胞間連接不緊密，取得大腦皮質(zhì)后，用眼科剪剪碎，直接輕柔吹打即可，最后將細(xì)胞懸液用細(xì)胞篩過(guò)濾，可以得到高存活率的單細(xì)胞懸液。

2.2.5 細(xì)胞過(guò)篩 目的是最大限度將腦組織分離為單細(xì)胞，并去除未剝離干凈的腦膜。許多研究者在實(shí)驗(yàn)中采用100目細(xì)胞篩（孔徑150 μm）[4]、200目細(xì)胞篩（孔徑75 μm）[5?6]、400目細(xì)胞篩（孔徑38 μm）[7]等不同孔徑的篩網(wǎng)。本課題組采用以上3個(gè)規(guī)格的細(xì)胞篩過(guò)濾后，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有少量腦膜存在。NSCs的形態(tài)近似于圓形，直徑在5～10 μm，因此課題組先后采用200目和500目細(xì)胞篩（孔徑30 μm）過(guò)濾，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)殘存的腦膜，而且可以將絕大部分腦組織分離成單細(xì)胞。此外，少量腦膜的存在對(duì)于NSCs成球率和未分化狀態(tài)的穩(wěn)定性無(wú)影響。

3 培養(yǎng)基選擇的依據(jù)

血清含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)有積極作用。但有研究表明含血清培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)NSCs分化，不利于維持NSCs處于未分化狀態(tài)[8]，因此課題組采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCs。大部分研究者采用由DMEM/F12（98%）+B27（2%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的培養(yǎng)基。DMEM/F12培養(yǎng)基是NSCs體外培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]。有研究指出B27能促進(jìn)原代NSCs的增殖[10]。值得注意的是，Gibco公司生產(chǎn)的B27有多種類型，其中不含維生素A的B27不會(huì)誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化，有利于保持NSCs處于未分化狀態(tài)。bFGF可以促進(jìn)NSCs的增殖[11]。EGF既可以促進(jìn)NSCs的增殖，又可以促進(jìn)其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。bFGF與EGF聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)NSCs體外增殖，抑制其分化[12]。本課題組采用由DMEM/F12（97%）+B27（2%）+青鏈霉素（1%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的NSCs無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)出了狀態(tài)良好的神經(jīng)球。需要注意的是，為保持bFGF和EGF的最大活性，每次應(yīng)少量配制培養(yǎng)基。

4 接種密度的選擇

NSCs的生長(zhǎng)密度對(duì)于其自身的增殖有重要的影響[13]。如果細(xì)胞密度過(guò)高，細(xì)胞則會(huì)聚集成團(tuán)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，活性降低，甚至?xí)霈F(xiàn)大量死亡的狀況。如果細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞之間缺乏有效的連接，造成增殖速度減慢。因此掌握好NSCs的接種密度對(duì)于其生長(zhǎng)十分關(guān)鍵。文獻(xiàn)中提及NSCs的接種密度從 1×105～1×107個(gè)/mL不等[14?16]。課題組按照1×105、1×106和1×107個(gè)/mL 3個(gè)密度進(jìn)行接種，結(jié)果顯示1×106個(gè)/mL的NSCs成球速度快，神經(jīng)球數(shù)量多且狀態(tài)良好。

5 不同培養(yǎng)方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響

目前NSCs的培養(yǎng)方法主要有懸浮培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)法。本課題組證實(shí)采用懸浮培養(yǎng)法可以形成穩(wěn)定的神經(jīng)球，有利于保持NSCs處于未分化的狀態(tài)，而采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞則非常容易分化。需要注意的是，在懸浮培養(yǎng)NSCs的過(guò)程中，拿、放培養(yǎng)瓶要盡量平穩(wěn)，以免造成細(xì)胞球聚集形成較大的細(xì)胞團(tuán)塊。

6 不同換液方式的體會(huì)

縱觀研究人員對(duì)NSCs的換液方法，有全量換液和半量換液，其中多數(shù)采用半量換液的方法。NSCs本身就是未充分發(fā)育的細(xì)胞，所以較其他細(xì)胞而言更加脆弱，對(duì)外界環(huán)境的變化更加敏感，因此維持NSCs生長(zhǎng)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定十分重要，頻繁換液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。NSCs生長(zhǎng)不只是吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，還與NSCs自身分泌的活性物質(zhì)（如生長(zhǎng)因子、黏附分子和趨化因子等）有關(guān)，NSCs通過(guò)自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)自身的生物學(xué)特性，因此不推薦使用全量換液的方法。而只加液不棄液的方法較半量換液更方便，因此推薦使用每2～3 d只加液不棄液（25 cm2培養(yǎng)瓶每次添加培養(yǎng)基1～1.5 mL）的方法。

7 傳代經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

7.1 傳代時(shí)機(jī) 懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球狀態(tài)是判斷傳代時(shí)機(jī)的重要依據(jù)。據(jù)觀察，活力好的神經(jīng)球通常透光均勻且邊緣明亮銳利。神經(jīng)球的直徑不宜過(guò)大，直徑超過(guò)300 μm的神經(jīng)球球心部較邊緣厚很多，透光性減弱，球心部顏色較邊緣暗。本課題組將NSCs培養(yǎng)至6～8 d，得到的神經(jīng)球數(shù)量多、狀態(tài)良好，適宜傳代。

7.2 傳代方法 NSCs傳代方法主要有胰酶消化法、Accutase酶消化法[17]和機(jī)械吹打法等。酶消化法操作步驟：將含有NSCs的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管，靜置15 min，去上清，加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶，消化10 min，加入培養(yǎng)基終止消化，以1 500 r/min離心10 min，去上清，加入培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶。機(jī)械吹打法操作步驟：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管，靜置15 min，去上清，加入培養(yǎng)基，輕柔緩慢吹打10 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶。原代和1代的神經(jīng)球細(xì)胞間連接不緊密，僅通過(guò)輕柔的吹打即可分離成單細(xì)胞懸液，且傳代后活細(xì)胞比例最高，成球率最高，神經(jīng)球可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)，吹打時(shí)要輕柔且避免產(chǎn)生氣泡。2代及以后神經(jīng)球通過(guò)單純機(jī)械吹打無(wú)法使其完全分離為單細(xì)胞。采用胰酶消化法不容易掌握消化時(shí)間，對(duì)細(xì)胞損傷較大，活細(xì)胞比例相對(duì)較低，再次成球率低。損傷的細(xì)胞釋放其核內(nèi)DNA，這些DNA具有很強(qiáng)的黏性，會(huì)將分離消化的單細(xì)胞黏附在一起。本課題組對(duì)原代和1代的神經(jīng)球采用機(jī)械吹打法進(jìn)行傳代，對(duì)2代及以后的神經(jīng)球采用Accutase酶進(jìn)行傳代。利用Accutase酶消化2代及以后的神經(jīng)球?qū)?xì)胞損傷最小，活細(xì)胞比例較高，成球率較高，神經(jīng)球狀態(tài)良好。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)死細(xì)胞、細(xì)胞碎片及細(xì)胞分解產(chǎn)物，如果不能及時(shí)清理這些物質(zhì)則會(huì)影響NSCs的增殖。在傳代過(guò)程中，使神經(jīng)球自然沉淀，然后去除上清液，這些物質(zhì)可以被最大程度地去除。原代培養(yǎng)的NSCs中混有一些雜細(xì)胞，經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代培養(yǎng)后也可以被去除。

本課題組已經(jīng)穩(wěn)定傳代培養(yǎng)NSCs至第7代。馬浚寧等[18]發(fā)現(xiàn)從皮質(zhì)提取的NSCs在傳至9～11代后會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)球貼壁的現(xiàn)象，海馬和嗅球區(qū)的NSCs也有類似現(xiàn)象，提示NSCs的懸浮特性會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而減弱。

8 神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的選擇

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NSCs標(biāo)志物有巢蛋白、Musashi、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、波形蛋白1、細(xì)胞黏附分子等。大部分研究者把巢蛋白作為鑒定NSCs的標(biāo)志物，巢蛋白又稱為nestin，屬于Ⅵ型中間絲蛋白，其表達(dá)具有時(shí)序性，nestin在分裂增殖能力旺盛的NSCs中高表達(dá)，在NSCs向終末細(xì)胞（神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）分化過(guò)程中逐漸減弱，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體外培養(yǎng)的NSCs的鑒定[19]。

9 總結(jié)

提取胎齡14 d胎鼠的大腦皮質(zhì)，采用無(wú)血清培養(yǎng)基，以1×106個(gè)/mL的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶（接種約3.5 mL），采取懸浮培養(yǎng)法，每2～3 d加液1～1.5 mL，每6～8 d傳代1次，所得到的NSCs增殖分裂旺盛、成球率高、神經(jīng)球狀態(tài)良好，并且可以保持穩(wěn)定的未分化狀態(tài)。該方法值得參考。