內(nèi)皮素-1對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1的影響及其機(jī)制*

汪晨?jī)簦?裴淑燕， 南曉東， 馬艷慶

(1. 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能教研室, 甘肅 蘭州 730030; 2. 武警甘肅總隊(duì)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 蘭州 730050)

隨著動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, ATH)發(fā)生機(jī)制研究的不斷深入，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)激活，及其所引發(fā)的慢性血管炎癥反應(yīng)在ATH病理過(guò)程中的關(guān)鍵性作用已得到共識(shí)[1,2]。

大量的研究證實(shí)，外周血中單核細(xì)胞趨化、黏附于損傷內(nèi)膜，并侵入動(dòng)脈壁是ATH發(fā)生過(guò)程中最早期的中心事件。盡管此過(guò)程受多種趨化因子影響，但起關(guān)鍵作用的是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)[3]。MCP-1對(duì)單核吞噬細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化作用，可與其受體—趨化因子受體2(chemokine C-C-motif receptor 2, CCR2)結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)的磷酸肌醇等信號(hào)通路，特異性地趨化并激活單核/巨噬細(xì)胞黏附、遷移進(jìn)入內(nèi)膜下層[4]。此外，MCP-1也可作用于VSMCs上的CCR2，直接刺激VSMCs增殖和遷移[5]。而在ATH發(fā)生后期，MCP-1對(duì)于促進(jìn)斑塊的形成和破裂也起到重要作用[6]。MCP-1可通過(guò)多種途徑直接參與或影響ATH慢性炎癥反應(yīng)的多個(gè)病理過(guò)程。

MCP-1可由多種細(xì)胞合成與分泌。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-1、TNF-α、PKC和AngII等炎性因子或血管活性物質(zhì)的刺激下，MCP-1可由VSMCs產(chǎn)生[7,8]。Takahashi等[9]以鼠抗人MCP-1單克隆抗體進(jìn)行的免疫組化研究也表明，MCP-1在ATH病灶中的表達(dá)主要位于VSMCs。據(jù)此認(rèn)為，在ATH血管炎癥反應(yīng)過(guò)程中VSMCs不僅是MCP-1的效應(yīng)器，亦是ATH過(guò)程中MCP-1的重要來(lái)源。

血管活性肽-內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)是ET家族中重要成員之一，可由主要分布于VSMCs、心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的ET-1受體(endothelin-1 receptor, ETR)ETAR、ETBR介導(dǎo)，參與多種心血管疾病的發(fā)病過(guò)程[10]。近年來(lái)的研究表明，ET-1不僅與ATH病理過(guò)程中的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)，還直接參與了這一過(guò)程中VSMCs、單核細(xì)胞、白細(xì)胞等炎性細(xì)胞的激活和趨化。ET-1亦可刺激VSMCs異常增殖、遷移及重塑；可誘導(dǎo)VSMCs和單核細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子[11, 12]，進(jìn)而參與ATH發(fā)生、發(fā)展中的慢性血管炎癥反應(yīng)。

盡管已有研究證實(shí)了來(lái)源于VSMCs的MCP-1和ET-1激活VSMCs在ATH慢性血管炎癥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制中的重要作用，然而這兩者之間可能存在的相互作用及其作用機(jī)制在ATH慢性血管炎癥病理進(jìn)程中的意義目前并不十分明晰。由此，本文擬探討ET-1對(duì)VSMCs產(chǎn)生MCP-1的影響及其機(jī)制，以期為進(jìn)一步揭示ET-1經(jīng)由激活VSMCs及血管炎癥性反應(yīng)而介導(dǎo)ATH的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性 SD 大鼠，3～4月齡，200～250 g (購(gòu)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 藥品和試劑

ET-1、BQ123、BQ788、SB203580及SP600125(Alexis)，PD98059(Cayman)，NAC、PDTC(Sigma)，DMEM(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，兔抗大鼠ERK、phospho-ERK、p38MAPK、phospho-p38MAPK、JNK及phospho-JNK抗體(Cell Signaling Technology)，小鼠抗大鼠β-actin抗體(Abcam)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗(Pioneer biotechnology Inc)，MCP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(深圳晶美)，兔SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒及兔抗大鼠α-actin多克隆抗體(北京博奧森)，RNAfast1000-總RNA 提取試劑盒(上海飛捷生物)，Thermo Scientific RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒K1622(德國(guó)Fementas)，2×Taq PCR MasterMix試劑盒(Beijing Aide Lai Biotechnology Co., Ltd)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Sheldon公司)，Olympus倒置相差顯著鏡(日本Olympus公司)，TC-512 Thermal Cycler DNA擴(kuò)增儀(英國(guó)Techne)，DYY-7C 型轉(zhuǎn)移電泳儀(北京六一儀器廠)，Gel DOC2000凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Image master VDS 掃描儀(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司)。

1.4 VSMCs培養(yǎng)

按文獻(xiàn)組織貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMCs[13]。分離雄性SD大鼠胸主動(dòng)脈段血管，置于含10 %胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，采用3～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 VSMCs鑒定

倒置相差顯微鏡下，VSMCs增殖到一定時(shí)期，VSMCs呈典型“峰”和“谷”狀。用SP組化試劑盒及兔抗大鼠α-actin抗體進(jìn)行VSMCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定培養(yǎng)細(xì)胞。

1.6 ELISA法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)濃度

VSMCs同步化后，分為ET-1刺激組及阻斷劑干預(yù)組。ET-1刺激組：VSMCs與不同濃度ET-1(10-9，10-8，10-7，10-6mol/L)分別孵育(0、6、12、24、48 h)；阻斷劑干預(yù)組：VSMCs預(yù)先30 min分別加入ETAR拮抗劑BQ123(10-5mol/L)、ETBR拮抗劑BQ788(10-5mol/L)、抗氧化劑NAC(10-5mol/L)、ERK抑制劑PD98059(10-5mol/L)、p38MAPK抑制劑SB203580(10-5mol/L)、JNK抑制劑SP600125(10-5mol/L)及 NF-κB抑制劑PDTC(10-5mol/L)，再加入ET-1(10-7mol/L)孵育24 h。按預(yù)定時(shí)間收集VSMCs上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA法測(cè)定大鼠VSMCs上清液中MCP-1的蛋白質(zhì)濃度，以反映大鼠VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)大鼠VSMCs中MCP-1 mRNA的表達(dá)量

VSMCs同步化后，分為ET-1刺激組及阻斷劑干預(yù)組。ET-1刺激組：VSMCs與不同濃度ET-1(10-9，10-8，10-7，10-6mol/L)分別孵育24 h；阻斷劑干預(yù)組：VSMCs處理與1.2.3 中阻斷劑干預(yù)組相同。按預(yù)定時(shí)間棄去VSMCs上清液，PBS沖洗后，用RNAfast1000-總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。取總RNA 1 μg，用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物 2 μl 作為PCR擴(kuò)增模板。MCP-1上游及下游引物序列分別為：5’- AGG TCT CTG TCA CGC TTC TG -3’，5’- CTG GTG ATT CTC TTG TAG TTC TCC -3’(NM-031530.1)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為163 bp；內(nèi)參基因GAPDH上游及下游引物序列分別為：5’-GCA AGT TCA ACG GCA CAG TCA AG-3’，5’-ACA TAC TCA GCA CCA GCA TCA CC-3’(NM-017008.3)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為124 bp。各引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系中包含MgCl2、dNTP引物和Taq-DNA 聚合酶。PCR擴(kuò)增條件為：94℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、60 s，循環(huán)35次；72℃、5 min。PCR結(jié)束后，取5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈透射觀察、拍照并分析結(jié)果，以目的基因MCP-1與內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增條帶的信號(hào)強(qiáng)度比值反映MCP-1 mRNA的表達(dá)量。

1.8 Western blot 法測(cè)定大鼠VSMCs ERK、phospho-ERK、p38MAPK、phospho-p38MAPK、JNK及phospho-JNK蛋白質(zhì)表達(dá)量

VSMCs同步化后，預(yù)先分別加入BQ123(10-5mol/L)、BQ788(10-5mol/L)、PD98059(10-5mol/L)、SB203580(10-5mol/L)及SP600125(10-5mol/L)孵育20 min，再以ET-1(10-7mol/L)刺激5 min。然后提取VSMCs胞漿蛋白并定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離目的蛋白，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描分析并拍照，Gel Pro軟件進(jìn)行條帶的掃描分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用灰度值表示，并將同一樣本目的和內(nèi)參蛋白所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行比較得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。一抗：p-ERK、ERK、p-p38MAPK、p38MAPK、p-JNK兔抗大鼠單克隆抗體、JNK兔抗大鼠多克隆抗體及小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體濃度分別為1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000 及 1∶10 000。二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，羊抗小鼠IgG抗體濃度分別為 1∶5 000、1∶10 000。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的鑒定及純度

培養(yǎng)5～6 d 時(shí)，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)組織塊周?chē)猩倭考?xì)胞游出，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，放射狀生長(zhǎng)。培養(yǎng)兩周左右局部成束的細(xì)胞平行排列，呈典型高低起伏的“峰”、“谷”狀(圖 1A)。第 3 代VSMCs α-actin 免疫組化染色表明：陽(yáng)性染色細(xì)胞大于99%，即胞漿呈棕黃色細(xì)顆粒狀染色，胞核不著色，證實(shí)為高純度VSMCs(圖1B)。

Fig.1The identification of VSMCs

A: The third passage of rat aorta VSMCs (× 100); B: Expression of α-actin in aorta VSMCs observed by immunocytochemical staining with anti-rat α-actin polyclonal antibody (× 400); VSMCs: Vascular smooth muscle cells

2.2 ET-1對(duì)大鼠VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)及mRNA的影響

ELISA及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明： ET-1(10-9，10-8，10-7，10-6mol/L)刺激VSMCs不同時(shí)間，MCP-1蛋白質(zhì)濃度隨ET-1濃度和時(shí)間的增加而呈增高趨勢(shì)。ET-1(10-9，10-8，10-7，10-6mol/L)刺激VSMCs 24 h后，MCP-1 mRNA表達(dá)量也隨ET-1濃度的增加而升高，其表達(dá)量分別為0.18±0.06、0.34±0.07、0.55±0.08、0.75±0.08。與對(duì)照組比較，ET-1(10-8、10-7、10-6mol/L)能明顯升高M(jìn)CP-1蛋白質(zhì)濃度及mRNA表達(dá)量，差異有顯著性(P<0.01)。與0 h比較，10-9，10-8，10-7，10-6mol/L ET-1刺激VSMC 6 h，12 h，24 h， 48 h均能明顯升高M(jìn)CP-1蛋白質(zhì)濃度，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。在阻斷劑干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，ET-1(10-7mol/L)能顯著升高VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)濃度及mRNA表達(dá)量，差異有顯著性(P<0.01)；與單獨(dú)使用ET-1(10-7mol/L)組比較，BQ123、NAC、PD98059、SB203580及PDTC能顯著抑制ET-1誘導(dǎo)的VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)(P<0.01)，而B(niǎo)Q788及SP600125對(duì)此作用無(wú)明顯影響(表1，圖2，圖3)。

Tab. 1 Time-and-concentration effects of ET-1-induced MCP-1 protein production (ng/L, n=3)

ET-1: Endothelin-1; MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vs0 h

ET-1: Endothelin-1; MCP-1: Monocyte chemotactic protein-1

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsET-1 alone

2.3 ET-1對(duì)大鼠VSMCs p-ERK及p-p38MAPK表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)B結(jié)果顯示：正常培養(yǎng)情況下，對(duì)照組VSMCs胞漿內(nèi)以非磷酸化的ERK、p38MAPK表達(dá)為主，僅有少量p-ERK、p-p38MAPK。ET-1可明顯提高p-ERK及p-p38MAPK水平。與對(duì)照組相比，p-ERK/ERK、p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著升高(P<0.01)，提示ET-1可激活ERK、p38MAPK通路。與單獨(dú)使用ET-1組比較，BQ123、NAC與PD98059 或 SB203580均可顯著減少ET-1誘導(dǎo)的ERK、p38MAPK磷酸化(P<0.05，P<0.01)；而B(niǎo)Q788不能對(duì)p-ERK及p-p38MAPK的表達(dá)產(chǎn)生明顯影響。說(shuō)明ETAR及ROS介導(dǎo)了ERK、p38MAPK的磷酸化作用(表2，圖4，圖5)。

2.4 ET-1對(duì)大鼠VSMCs p-JNK水平的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：正常情況下，對(duì)照組VSMCs胞漿內(nèi)以非磷酸化的JNK表達(dá)為主，僅有少量p-JNK存在。與對(duì)照組比較，ET-1(10-7mol/L)對(duì)p-JNK水平無(wú)明顯影響，提示ET-1對(duì)JNK通路無(wú)明顯激活作用。與單獨(dú)使用ET-1(10-7mol/L)比較，BQ123、BQ788、NAC 及 SP600125 對(duì)ET-1刺激后p-JNK/JNK比值亦均無(wú)明顯影響(表2，圖6)，說(shuō)明ET-1刺激后，VSMCs未發(fā)生明顯的JNK磷酸化反應(yīng)。

A: Concentration effect of ET-1-induced MCP-1 mRNA expression; B: Effect of different blockers on ET-1-stimulated MCP-1 mRNA expression

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsET-1 alone

Groupp-ERK/ERKp-p38MAPK/p38MAPKp-JNK/JNKControl0.45±0.14**0.26±0.04**0.20±0.02ET-1 alone1.73±0.291.80±0.150.23±0.02BQ123+ET-10.71±0.27*0.96±0.04**0.22±0.01BQ788+ET-11.55±0.531.58±0.100.23±0.02NAC+ET-10.90±0.28*1.05±0.04**0.21±0.02PD98059+ET-11.07±0.27* - -SB203580+ET-1 -1.17±0.05** -SP600125+ET-1 - -0.21±0.01

*P<0.05,**P<0.01vsET-1 alone

Fig.4Expressions of p-ERK, ERK and β-actin protein in VSMCs detected by Western blot

Fig.5Expressions of p-p38MAPK, p38MAPK and β-actin protein in VSMCs detected by Western blot

Fig.6Expressions of p-JNK, JNK and β-actin protein in VSMCs detected by Western blot

3 討論

ATH是缺血性心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制有“脂質(zhì)斑塊沉積”、“內(nèi)皮細(xì)胞損傷”等多種學(xué)說(shuō)。目前慢性炎癥反應(yīng)已逐漸成為ATH發(fā)病機(jī)制領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。炎性反應(yīng)過(guò)程中，致炎因子MCP-1通過(guò)與其特異性受體CCR2結(jié)合，不僅參與了單核/巨噬細(xì)胞的趨化、聚集，而且在VSMCs的增殖、遷移，粥樣斑塊的形成、破裂及血栓形成等ATH血管炎癥反應(yīng)的病理過(guò)程中起著重要作用[5, 6, 14]。同時(shí)已有研究證實(shí)，VSMCs作為參與ATH的關(guān)鍵性的細(xì)胞成分可能在血管活性物質(zhì)的刺激下成為炎性因子的重要來(lái)源[11]。

ET-1是ET家族中生物學(xué)活性最強(qiáng)、作用持續(xù)時(shí)間最久的縮血管活性物質(zhì)[15]，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。ETAR和ETBR是ET-1的兩種特異性受體，ETAR主要分布于VSMCs，ETB2R主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞。新近研究發(fā)現(xiàn)：在ATH的病理過(guò)程中，ET-1與其不同受體結(jié)合后，經(jīng)由ROS、MAPK通路等多個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不僅可以引起內(nèi)皮損傷、刺激VSMCs凋亡、遷移、增殖和纖維化，同時(shí)還能誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生炎性因子，進(jìn)而參與ATH的炎癥反應(yīng)[16-18]。

MCP-1在ATH炎癥反應(yīng)中的作用及ET-1特異性ETAR的VSMCs分布特性和作用則提示：ET-1可能也是ATH血管炎癥反應(yīng)過(guò)程中激活VSMCs產(chǎn)生MCP-1的又一重要刺激物。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：ET-1能誘導(dǎo)大鼠VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)。ETAR抑制劑BQ123能顯著抑制ET-1的此種效應(yīng)，而ETBR抑制劑BQ788的抑制作用并不明顯，提示ET-1誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生MCP-1主要通過(guò)VSMCs上ETAR介導(dǎo)。此外，抗氧化劑NAC、ERK、p38MAPK及NF-κB抑制劑PD98059、SB203580及PDTC亦能抑制上述ET-1刺激條件下VSMCs MCP-1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)，說(shuō)明ROS、ERK、p38MAPK及NF-κB可能參與了ET-1誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生MCP-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同時(shí)，BQ123、NAC與PD98059或SB203580能分別抑制ET-1刺激條件下VSMCs 胞漿中ERK及p38MAPK的磷酸化，進(jìn)一步證明ETAR、ROS及MAPK信號(hào)分子(ERK、p38MAPK)是ET-1誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生MCP-1信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子。

綜上所述，本研究揭示血管活性肽ET-1能通過(guò)ROS、MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生MCP-1，提示ET-1→ETAR→ROS→MAPK→NF-κB→MCP-1可能是ATH過(guò)程中VSMCs激活觸發(fā)慢性血管炎癥反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生MCP-1的又一新的重要途徑，這將為ATH的臨床防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。但有關(guān)這一途徑的詳細(xì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，及其與ET-1其他致炎、致ATH途徑之間的相互關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。