抗細(xì)胞趨化因子CCL21單克隆抗體處理對(duì)小鼠急性心肌梗死后左心室重構(gòu)及心功能的影響*

蔣 易， 燕艷麗， 白建文

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院急診內(nèi)科， 上海 200120)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常見(jiàn)的冠狀動(dòng)脈心血管疾病，起病急、進(jìn)展快，常伴有心律失常和心臟衰竭，病死率極高。炎癥反應(yīng)是AMI過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，梗死區(qū)內(nèi)心肌細(xì)胞大量壞死可導(dǎo)致組織內(nèi)急劇炎癥反應(yīng)，白細(xì)胞和單核細(xì)胞快速被募集并伴有大量細(xì)胞因子釋放，最終導(dǎo)致心室擴(kuò)張和心臟重構(gòu)[1]。有效控制急性心肌梗死后趨化因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是當(dāng)前治療急性心肌梗死和提高梗死后心臟功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

C-C家族趨化因子配體21(C-C chemokine ligand 21, CCL21)是細(xì)胞趨化因子C-C家族成員之一，能促進(jìn)初始和效應(yīng)T細(xì)胞遷移到炎癥和感染部位。CCL21主要與C-C家族趨化因子受體7(C-C chemokine receptor 7, CCR7結(jié)合)，參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢和進(jìn)入次級(jí)淋巴組織。CCL21/CCR7廣泛表達(dá)于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞核和內(nèi)皮細(xì)胞等非淋巴組織，并參與了炎癥調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖和基質(zhì)重塑等生物學(xué)效應(yīng)[2]。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌組織降解和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，因此，及時(shí)有效地抑制心肌梗死后炎癥反應(yīng)對(duì)于預(yù)防心肌梗死后心室重塑和保護(hù)心臟功能有重要意義。本研究擬采用小鼠心肌梗死模型探討抗CCL21單克隆抗體處理對(duì)急性心肌梗死后左心室重構(gòu)及心功能的影響，旨在為預(yù)防心肌梗死后心室重構(gòu)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 建立小鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型

雄性C57 BL/6小鼠(8～12)周齡，體重(23～25) g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，C57BL/6小鼠先隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和CCL21單抗干預(yù)組，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因麻醉手術(shù)等意外死亡的小鼠均不列入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)，存活小鼠再進(jìn)一步隨機(jī)分為1、3、7和21 d亞組，每組8只。小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)模型制作過(guò)程如下，在吸入麻醉狀態(tài)下，于小鼠左側(cè)第3、4肋間隙切開(kāi)，暴露心臟，永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；假手術(shù)組只掛線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，建模成功率為70%。分別在小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后5 min和3 d后，假手術(shù)組和模型組靜脈注射山羊抗小鼠Ig-G同型血清1.0 mg，CCL21單抗干預(yù)組靜脈注射山羊抗小鼠CCL21單克隆抗體1.0 mg。

1.2 ELISA法檢測(cè)血清CCL21、TNF-α和IL-6濃度

分別在小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后的第1、3、7天，眼眶后靜脈叢取血，血樣靜置2 h，2 500 r/min離心15 min，收集血清。采用美國(guó)BD公司小鼠CCL21、TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。

1.3 Western blot檢測(cè)心肌組織CCR7、MMP-2和MMP-9的表達(dá)

分別在建模后第1、3和7天檢測(cè)，每次每組檢測(cè)8只。每次檢測(cè)時(shí)提取心肌組織總蛋白質(zhì)并定量，SDS-PAGE后冰浴轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別滴加抗β-actin單克隆抗體(1:1 000稀釋)、抗CCR7多克隆抗體(1:500稀釋)、抗MMP-2多克隆抗體(1:500稀釋)和抗MMP-9多克隆抗體(1:500稀釋)(購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司)，均4 ℃孵育過(guò)夜。清洗后，滴加1:4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體(Abcam公司)，室溫孵育2 h。按增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)的使用說(shuō)明配制發(fā)光底物工作液，顯影、定影。用Image J軟件對(duì)各蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度掃描，以?xún)?nèi)參β-actin蛋白質(zhì)為基準(zhǔn)，計(jì)算CCR7、MMP-2和MMP-9的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 心臟超聲評(píng)價(jià)

冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)后第7天和第21天，小鼠吸入麻醉，使用Sonos 4500小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(Philips公司)行心臟超聲檢測(cè)(探頭頻率15～16 MHz)。探頭經(jīng)胸骨旁長(zhǎng)軸獲得左心室M型超聲影像，分別測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)，左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)。心臟功能相關(guān)指標(biāo)，包括左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)由儀器自動(dòng)計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急性心肌梗死對(duì)小鼠血清CCL21和心肌CCR7水平的影響

與假手術(shù)組小鼠相比，術(shù)后第1、3、7天急性心肌梗死模型組小鼠外周血中CCL21水平均顯著增高(P<0.05，圖1B)；心肌組織內(nèi)CCL21受體CCR7的表達(dá)水平也顯著增高(P<0.05，圖1C)。

2.2 抗CCL21單克隆抗體處理對(duì)小鼠心肌梗死后血清炎性因子水平的影響

與假手術(shù)組小鼠相比，在急性心肌梗死1天后和3天后，模型組小鼠外周血中TNF-α和IL-6水平均顯著增高(P<0.05)。急性心肌梗死1 d后，CCL21單抗干預(yù)組小鼠血清TNF-α和IL-6水平均顯著低于模型組(P<0.05，圖2)。

Fig.1Effect of AMI on serum levels of CCL21 and myocardial level of CCR7 (n=8)

AMI：Acute myocardial infarction；CCL21：C-C motif chemokine ligand 21；CCR7：C-C motif chemokine receptor 7.

*P<0.05,**P<0.01vssham-operated group

Fig.2Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on serum levels of TNF-α and IL-6 (n=8)

TNF-α：Tumour necrosis factor-alpha；IL-6：Interleukin-6

*P<0.05vssham-operated group,#P<0.05vsmodel group

2.3 抗CCL21單克隆抗體處理對(duì)小鼠心肌梗死后7 d心肌MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

Fig.3Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on the expression levels of myocardial MMP (n=8)

MMP2：Matrix metalloproteinase 2；MMP9：Matrix metalloproteinase 9

*P<0.05vssham-operated group;#P<0.05vsmodel group

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與假手術(shù)組小鼠相比，冠脈結(jié)扎7 d后小鼠心肌組織中MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著增高(P<0.05)。給予抗CCL21單克隆抗體處理可有效逆轉(zhuǎn)MMP-9表達(dá)水平的增高(P<0.05)，但是對(duì)心肌MMP-2表達(dá)水平增高無(wú)明顯影響。

2.4 抗CCL21單克隆抗體處理對(duì)小鼠心臟功能的影響

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠在心肌梗死后7 d和21 d，LVEED和LVESD均顯著增高，LVEF和LVFS均顯著降低。與模型組相比，給予抗CCL21單克隆抗體處理有效降低了術(shù)后7 d和21 d組小鼠LVEED和LVESD水平；給予抗CCL21單克隆抗體處理顯著提高21 d組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)水平(表1)。

3 討論

心肌梗死后心臟重構(gòu)嚴(yán)重影響心臟收縮和泵血功能，是急性心肌梗死患者在恢復(fù)期面臨的主要風(fēng)險(xiǎn)。梗死組織愈合主要取決于趨化因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，膠原增生形成的瘢痕最終替代壞死的心肌組織?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是促進(jìn)梗死區(qū)和非梗死區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白水解酶。其中，MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一個(gè)重要成員，可降解Ⅳ型膠原等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-9在AMI后早期主要由中性粒細(xì)胞分泌，隨后主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌[3]。MMP使心臟膠原降解亢進(jìn)，引起梗死周邊區(qū)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致心肌梗死后的心室重構(gòu)、室壁瘤形成以及心臟破裂。本研究發(fā)現(xiàn)，冠脈結(jié)扎7 d后小鼠心肌組織中MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)水平均顯著增高。給予抗CCL21單克隆抗體處理可有效逆轉(zhuǎn)MMP-9表達(dá)水平的增高，但是對(duì)MMP-2表達(dá)增高無(wú)明顯影響。

Tab. 1 Effect of anti-CCL21 monoclonal antibody treatment on cardiac function n=8)

LVEDD: Left ventricular end-diastolic diameter; LVESD: Left ventricular end-systolic diameter, LVEF: Left ventricular ejection fraction; LVFS: Left ventricular fractional shortening

*P<0.05vssham-operated group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

梗死后心肌組織由炎癥期向增生期過(guò)渡的關(guān)鍵在于抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)瘢痕組織形成。最近研究發(fā)現(xiàn)，MMP在心血管疾病的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，MMP的作用底物除了細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)外，還包括一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及粘附分子等[4]。例如：MMP可以激活谷-亮-精氨酸基序(glutamate-isoleucine- arginine motif, ELR-motif)陽(yáng)性的CXC家族趨化因子(C-X-C family of chemokine)，包括CXCL5，CXCL6和CXCL8等。此外，MMP還可激活TNF-α及白介素等炎性因子，研究還發(fā)現(xiàn)NOD2敲除小鼠可通過(guò)減少炎性趨化因子釋放、單核細(xì)胞浸潤(rùn)及降低基質(zhì)MMP-9活性，有效避免心肌梗死后心肌重塑和左心功能降低[5]。炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，可激活成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化，同時(shí)促進(jìn)溶酶體酶和氧自由基的釋放，加重心肌損傷。抑制心肌梗死后炎性因子TNF-α和IL-6水平，可以有效改善梗死后糖尿病大鼠遠(yuǎn)期的心功能[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予抗CCL21單克隆抗體處理可有效逆轉(zhuǎn)冠脈結(jié)扎7 d后MMP-9水平增高，小鼠外周血中炎性因子TNF-α和IL-6水平也顯著低于假手術(shù)組。

心臟超聲檢查結(jié)果表明，抗CCL21單克隆抗體處理還有效逆轉(zhuǎn)了小鼠心肌梗死后左心室擴(kuò)張，LVEED和LVESD均顯著低于假手術(shù)組小鼠。在抗CCL21單克隆抗體處理組小鼠，反映左心室功能的指標(biāo)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)均顯著優(yōu)于假手術(shù)組小鼠?；|(zhì)金屬蛋白酶MMPs是水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶，急性心肌梗死后MMPs的表達(dá)和活性增強(qiáng)，可導(dǎo)致正常心肌膠原蛋白過(guò)度降解，并被纖維間質(zhì)取代，導(dǎo)致心臟組織重構(gòu)，心臟功能降低。臨床研究表明，MMP水平是決定心肌梗死患者預(yù)后的關(guān)鍵因子，患者M(jìn)MP水平越高，其臨床預(yù)后越差[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，特異性敲除mmp-9基因的小鼠在急性心肌梗死后可刺激梗死后組織內(nèi)血管形成，其左心室功能恢復(fù)顯著優(yōu)于對(duì)照組小鼠[8]。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ZFP580(zinc finger protein-580)通過(guò)下調(diào)MMP-3的表達(dá)調(diào)控心肌細(xì)胞外基質(zhì)形成，從而影響了心肌缺血/再灌注損傷后心室重塑的過(guò)程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管抗CCL21單克隆抗體處理可以有效逆轉(zhuǎn)MMP-9水平增高，但對(duì)MMP-2水平增高則無(wú)明顯影響，推測(cè)其他調(diào)節(jié)機(jī)制可能參與了心肌梗死后MMP-2水平調(diào)節(jié)。盧彥珍等發(fā)現(xiàn)，MMP-2釋放和活性增高與心肌間質(zhì)的破壞和心功能損害存在明顯相關(guān)性，缺血/再灌注過(guò)程中體內(nèi)氧自由基生成增加或清除不足導(dǎo)致心肌基質(zhì)金屬蛋白酶激活，使心肌膠原降解和破壞[10]?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為抗CCL21單克隆抗體處理對(duì)梗死后心肌組織的保護(hù)效應(yīng)可能與抑制梗死后MMP-9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)左心室功能、防止梗死后心臟重構(gòu)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)使用抗CCL21單克隆抗體處理可明顯抑制急性心肌梗死后心肌MMP-9表達(dá)增高和炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)梗死后心臟重構(gòu)和提高心臟功能的作用。