花生甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)基因的克隆及表達(dá)分析

郝翠翠，梁成偉，石 蕾，李昊遠(yuǎn),3，陳明娜，潘麗娟， 王 通，王 冕，禹山林，陳 娜*，遲曉元*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209)

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的油料作物、也是一種經(jīng)濟(jì)型農(nóng)作物及出口創(chuàng)匯作物。我國花生產(chǎn)量約占國內(nèi)油料作物總產(chǎn)量的50%[1-2]。我國每年有一半以上的花生被用來榨油，花生油消費(fèi)量在每年2000 kt以上，占食用植物油消費(fèi)量的25%左右。目前，我國食用植物油的需求呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面。開展油料作物研究，提升植物油自給率迫在眉睫?；ㄉ诒Ｕ衔覈秤弥参镉凸┙o中具有明顯的潛力和優(yōu)勢，研究花生油脂合成過程及機(jī)理，提高花生油脂含量，才能符合未來對(duì)于植物油脂的消費(fèi)需求。

GPATs在植物油脂生物合成過程中扮演著重要角色，其主要作用是催化?；o酶A(acyl-CoA)上的脂肪酸連接到3-磷酸甘油的sn-1位點(diǎn)上，形成溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)，是生物合成過程中的第一步反應(yīng)[3]。GPAT基因已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、向日葵(Helianthusannuus)、菠菜(Spinaciaoleracea)、油桐(Jatrophacurcas)、番茄(Lycopersicumesculentum)和豌豆(Pisumsativum)等多種植物中克隆出來[4]。其中，模式生物擬南芥GPAT基因家族有10個(gè)成員：ATSl、GPAT1-9。

已有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtGPAT9基因與種子含油量有關(guān)，可能參與了TAG的合成，同時(shí)，其他植物中的GPAT在提高種子含油量和油脂質(zhì)量方面，也具有非常重要的作用[5-7]。為探究GPAT蛋白在花生油脂生物合成和逆境脅迫中的重要作用，本研究從課題組已有的cDNA文庫中獲得2個(gè)新的?；d體蛋白的基因全長，分別命名為AhGPAT3和AhGPAT5。將得到的完整序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)測定這兩個(gè)基因在花生不同組織器官、種子發(fā)育不同時(shí)期、多種逆境脅迫及激素處理下的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究花生GPAT在調(diào)控油脂生物合成中的功能奠定了理論基礎(chǔ)。兩基因的GenBank注冊(cè)號(hào)分別為KP109922和KP109923。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為花育33，由山東省花生研究所提供。播種花生種子，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期16 h光照/8 h黑暗，溫度28℃/22℃。在花生生長到三葉期時(shí)，分別采集根、莖、葉、子葉和下胚軸，盛花期采集花生花。花生開花下針后，分別采集其下針后12、24、36、48和60 d的種子。

花生生長到三葉期后進(jìn)行多種非生物脅迫和激素處理。鹽(NaCl 200 mmol/L)、低溫(4℃)、干旱(15% PEG6000)均處理0、4、8、12、24、72 h。水楊酸(SA，2 mmol/L)、過氧化氫(H2O2，10 mmol/L)均處理0、4、8、12、24、36、72 h；赤霉素(GA，100μmol/L)、乙烯利(ET，5 mmol/L)和脫落酸(ABA，100 μmol/L)均處理0、8、12、24、48、72 h；茉莉酸(JA，100 μmol/L)處理0、4、8、12、24、72 h。對(duì)照組：ABA和GA以相同濃度乙醇作為對(duì)照，其他以清水作對(duì)照。除低溫處理外，在進(jìn)行處理時(shí)，應(yīng)先將花生三葉期幼苗從土中小心取出，清洗去除根部泥土，再置于相應(yīng)條件下接受處理。除低溫、鹽和干旱處理外，其余處理還需要用溶液涂抹花生葉片。在處理的不同時(shí)間段分別取花生幼苗的葉片，放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成、目的基因的擴(kuò)增

在NCBI上搜索到擬南芥兩個(gè)蛋白序列，分別是AtGPAT3(NP_192104)和AtGPAT5(NP_187750)。利用BioEdit軟件從花生cDNA文庫(共計(jì)36741條EST序列)中搜索與上述兩個(gè)擬南芥的氨基酸序列相似性較高的序列，作為候選基因。最終從已知的花生cDNA文庫中找到了2個(gè)可能編碼甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶的基因的全長序列：AhGPAT3和AhGPAT5。根據(jù)此序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因全長引物。引物序列為AhGPAT3-F：5'-ATGGCTAAAATGTTCACCAT-3'和AhGPAT3-R：5'-CTACTTGTTGGAACTGCTGG-3'；AhGPAT5-F：5'-ATGGAGTGTGTTGTGTCTGA-3'和AhGPAT5-R：5'-TTACTGTAAAAACGGTTTAA-3'。參照陳娜等[8-9]的方法提取花生葉片總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

以cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得目的基因。PCR反應(yīng)條件如下：94℃ 2min；94℃ 30s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR所得目的片段切膠回收，鏈接到T載體后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHa5中，篩選陽性克隆進(jìn)行測序。將測序得到的序列進(jìn)行拼接，得到GPAT基因全長序列，初步分析后提交到GenBank中。

1.3 氨基酸序列分析

采用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的ORF finder查找基因的開放讀碼框；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的基本物理化學(xué)參數(shù)；采用TMHMM 2.0 Server分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；用GSDS(Gene structure display server)對(duì)基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI網(wǎng)站的BlastP工具分別對(duì)克隆得到的兩個(gè)基因進(jìn)行基因序列的相似性及同源性查找，并利用這些序列進(jìn)行基因同源性比較。結(jié)合Clustal X和BioEdit軟件將下載序列與AhGPAT3和AhGPAT5序列進(jìn)行比對(duì)，通過比對(duì)尋找序列之間的相似區(qū)域和保守性位點(diǎn)，尋找可能的進(jìn)化關(guān)系。

為了更好地分析確定GPAT基因的進(jìn)化關(guān)系，利用formatdb程序建立一個(gè)擁有6個(gè)基因組的數(shù)據(jù)庫。這6個(gè)基因組分別為：大豆(Glycinemax)基因組，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)基因組，蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula)基因組，團(tuán)藻(Volvoxcarteri)基因組，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因組和擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組數(shù)據(jù)?；蚪M數(shù)據(jù)均從phytozome(http://www.phytozome.org/)數(shù)據(jù)庫下載獲得。起始源序列用已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的擬南芥GPAT基因，利用BlastP和TBlastN程序，設(shè)定E值<1e-50，在新建立的基因組數(shù)據(jù)庫中搜索，然后以新搜索到的基因重復(fù)此過程，直到搜索不到新的序列為止[10]，最后合并搜索到的所有序列。采用ClustalW軟件對(duì)合并序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，然后采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化的分析。系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbour-Joining(距離鄰接法)方法構(gòu)建。

1.5 熒光定量PCR

采用Roche的LightCycler 2.0 instrument system進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)方法和條件參照陳娜等[8-9]的方法。采用Actin11為內(nèi)參基因，3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2-△△Ct方法分析[11]。 熒光定量采用如下引物：

qAhGPAT3-F： 5'-CTACATCACCACCACCAT -3'，

qAhGPAT3-R： 5'-GAAGAAGAGAAGAAGAAGAAGAG -3'；

qAhGPAT5-F： 5'-GATTCGGATGCTGGACAAG -3'，

qAhGPAT5-R： 5'-TCTATATCTGACTCACCAACA -3'；

qACT11-F： 5'-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC -3'；

qACT11-R： 5'-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC -3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhGPAT3和AhGPAT5基因的克隆

以花生葉片的cDNA第一條鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鏈接載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后篩選陽性克隆檢測，有特異性條帶，表明成功克隆兩基因。通過Blast搜索、序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定兩基因?yàn)镚PAT家族成員，并且分別與擬南芥AtGPAT3和AtGPAT5基因序列相似性高，聚類在一起，因此，將克隆得到的兩基因分別命名為AhGPAT3和AhGPAT5。其中，AhGPAT3基因全長1653 bp，編碼550個(gè)氨基酸；AhGPAT5基因全長1383 bp，編碼460個(gè)氨基酸 (圖1和圖2)。

圖2 AhGPAT5基因的核苷酸及氨基酸序列 Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of AhGPAT5

2.2 氨基酸序列分析

對(duì)AhGPAT3和AhGPAT5基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：AhGPAT3蛋白的理論分子量為62.38 kD，理論等電點(diǎn)為9.02，平均親水系數(shù)0.061。AhGPAT5蛋白的理論分子量為51.42 kD，理論等電點(diǎn)為9.36，平均親水系數(shù)0.223。

AhGPAT3蛋白含的550個(gè)氨基酸殘基中，Leu(L)含量最高，占氨基酸總數(shù)的12.2%；其次為Ser(S)、Val(V)、Phe(F)，分別占氨基酸總量的9.5%、8.2%和7.8%。含有55個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu)，占總數(shù)的10.00%；67個(gè)帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)，占總數(shù)的12.18%。在大腸桿菌中的半衰期10 h，穩(wěn)定系數(shù)38.40，屬穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類型。AhGPAT5蛋白含的460個(gè)氨基酸殘基中，Leu(L)和Val(V)含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的11.7%和11.1%；其次為Arg(R)、Gly(G)和Ser(S)，分別占氨基酸總量的7.4%、6.3%和6.3%。含43個(gè)帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu)，占總數(shù)的9.34%；59個(gè)帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)，占總數(shù)的12.83%。在大腸桿菌中的半衰期10 h，穩(wěn)定系數(shù)38.49，屬穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類型。

采用在線HNN數(shù)據(jù)庫對(duì)氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明AhGPAT3含α-螺旋185個(gè)，占33.64%；β-折疊54個(gè)，占9.82%；自由卷曲171個(gè)，占31.09%。AhGPAT5含α-螺旋173個(gè)，占37.61%；β-折疊50個(gè)，占10.87%；自由卷曲139個(gè)，占30.22%。

TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhGPAT3有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，AhGPAT5有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhGPAT3和AhGPAT5均屬于跨膜類蛋白。最近有研究認(rèn)為水稻中的OsGPAT3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[12]。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)AhGPAT3和AhGPAT5基因C端含有一個(gè)溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(lysophospholipid acyltransferase，LPLAT)。

在NCBI網(wǎng)站上搜索并下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、花生(ArachishypogaeaL.)GPATs蛋白家族氨基酸序列，對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示，AhGPAT3氨基酸序列與AtGPAT3、GmGPAT3、AhGPAT2氨基酸序列相似性較高，分別為70%、79%、和78%；與GmGPAT9、AtGPAT9、AhGPAT9氨基酸序列相似性較低，分別為44%、43%和38%。AhGPAT5氨基酸序列與AtGPAT5、GmGPAT5、AhGPAT6、GmGPAT6的氨基酸序列相似性較高，分別為79%、83%、62%、62%；與GmGPAT9、AtGPAT9、AhGPAT9氨基酸序列相似性較低，分別為43%、41%、40%。因此，AhGPAT3和AhGPAT5編碼蛋白與其他植物GPAT蛋白序列同源，來自于共同的祖先。

本研究克隆得到的AhGPAT3和AhGPAT5蛋白與其他植物GPAT蛋白的氨基酸序列比對(duì)(圖3)發(fā)現(xiàn)，蛋白序列的相似性很高。兩基因都具有典型的?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，并且包含四個(gè)高度保守的基序AT-Ι、AT-Ⅱ、AT-Ⅲ和AT-Ⅳ。二者都具有催化活性的氨基酸殘基組氨酸、天冬氨酸(AT-Ⅰ)，甘氨酸(AT-Ⅲ)，脯氨酸(AT-Ⅳ)；綁定位點(diǎn)氨基酸殘基精氨酸(AT-Ⅱ)、谷氨酸(絲氨酸，AT-Ⅲ)[13-14]。

圖3 花生與其他植物GPAT蛋白的氨基酸序列比對(duì) Fig.3 Comparison of GPAT amino acid sequences among peanut and other species

注：AT和HAD-like保守結(jié)構(gòu)域分別用方框、直線標(biāo)出；星號(hào)表示HAD結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基；三角形表示AT結(jié)構(gòu)域中有催化作用的氨基酸殘基；圓點(diǎn)表示AT結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基。

GenBank登錄號(hào):Arachishypogaea(AhGPAT1, JN032676; AhGPAT2, HQ589243; AhGPAT6, HQ589244; AhGPAT8, JX843442; AhGPAT9, JX843441),Arabidopsisthaliana(AtGPAT1, NP_563768; AtGPAT2, NP_563651; AtGPAT3, NP_192104; AtGPAT4, NP_171667; AtGPAT5, NP_187750; AtGPAT6, NP_181346; AtGPAT7, NP_196227; AtGPAT8, NP_191950; AtGPAT9, NP_568925),Glycinemax(GmGPAT1, XP_003545142; GmGPAT2, XP_003520759; GmGPAT3, XP_003536864; GmGPAT5,XP_006575508; GmGPAT6, XP_003529144; GmGPAT8, XP_003520970; GmGPAT9, XP_003533946).

Note: AT and HAD-like domains were boxed (ATI to AT-IV) or marked by lines (HAD-I to HAD-IV), respectively. Critical residues previously identified in similar proteins were marked by asterisks (HAD domain), dots (binding site in AT domain), triangles (catalytic residues in AT domain).

圖4 花生AhGPAT3和AhGPAT5的基因結(jié)構(gòu) Fig.4 The schematic diagram of the structure of AhGPAT3 and AhGPAT5 注：白色方框代表外顯子；細(xì)線代表內(nèi)含子；0代表內(nèi)含子相位。 Note: The white-boxes indicate exon, the line indicate intron, the 0 indicate intron phases.

根據(jù)已獲得的AhGPAT3和AhGPAT5基因的全長編碼序列(CDS)，本地BLAST花生全基因組數(shù)據(jù)庫，獲得花生AhGPAT3和AhGPAT5的基因組序列。AhGPAT3和AhGPAT5基因組全長分別為3324 bp和1456 bp。利用GSDS工具對(duì)兩基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和剪接特征分析。結(jié)果如圖4所示，AhGPAT3和AhGPAT3的基因結(jié)構(gòu)均包括2個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。AhGPAT3內(nèi)含子5'端剪接位點(diǎn)具有AG//GT保守序列，3'端剪接位點(diǎn)具有AG//GA保守序列；AhGPAT5內(nèi)含子5'端具有AG//G保守序列，3'端具有AG//T保守序列，可知AhGPAT3和AhGPAT5基因外顯子和內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的剪接方式符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)律[15-16]，即內(nèi)含子5'端剪接位點(diǎn)(受體)具有A(T/C/G)G//GT的保守序列，3'端剪接位點(diǎn)(供體)具有C(T)AG//G(A/T)的保守序列。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

如圖5所示，對(duì)AhGPAT3和AhGPAT5及其他植物GPAT蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出，所有的基因聚成了三個(gè)不同的分支：ATS1，GPAT1-8，GPAT9。通過對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和團(tuán)藻(Volvoxcarteri)的基因組搜索，發(fā)現(xiàn)了葉綠體定位的ATS1和GPAT9基因，但是沒有發(fā)現(xiàn)其他GPAT家族成員。據(jù)報(bào)道其他8個(gè)GPAT基因可能是植物特有的，在別的物種中不存在[17]。葉綠體定位的可溶性蛋白AhATS1與其他膜結(jié)合的GPAT家族成員關(guān)系較遠(yuǎn)。AhGPAT9與高等植物和綠藻的GPAT9蛋白聚在一起，與高等植物的GPAT1-GPAT8蛋白分離開來。GPAT1-GPAT8蛋白分成了3個(gè)亞家族。據(jù)報(bào)道GPAT4/6/8亞家族是最古老的，出現(xiàn)于高等植物進(jìn)化的初始階段(苔癬植物)。它們主要參與角質(zhì)和角質(zhì)類似物的形成。相反，磷酸酶缺乏的GPAT1-3和GPAT5/7亞家族后期分化產(chǎn)生伴隨著維管植物的產(chǎn)生[17]。AhGPAT3基因與高等植物的GPAT2和GPAT3基因聚在一起，AhGPAT5基因與高等植物的GPAT5和GPAT7基因聚在一起。GPAT1-GPAT3亞家族與GPAT4/6/8和GPAT5/7亞家族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，AhGPAT3和AhGPAT5基因編碼的蛋白雖然都屬于GPAT家族，但是二者進(jìn)化關(guān)系卻較遠(yuǎn)，它們?cè)谡{(diào)控植物油脂的合成方面可能具有不同的功能。

2.4 基因的表達(dá)特性分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分別檢測了AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生不同組織器官、種子發(fā)育不同時(shí)期、3種非生物脅迫條件和6種激素類處理下的表達(dá)特性。以花生Actin11(AhACT11)基因作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。

圖6顯示，在花生不同組織中，AhGPAT3基因在下胚軸和花中的表達(dá)量較高，分別為子葉和葉中表達(dá)量的4.8倍和168倍；在種子發(fā)育過程中，發(fā)育初期的基因表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量明顯下降。AhGPAT5基因在花生下胚軸中的表達(dá)量最高，約為花中表達(dá)量的2.4倍；在種子發(fā)育初期基因的表達(dá)量最高，發(fā)育中后期表達(dá)量極低。

圖7顯示，以0h花生三葉期幼苗為對(duì)照，在不同逆境脅迫及激素類處理下，花生葉片中AhGPAT3基因均明顯地誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因在這些脅迫下對(duì)花生抗逆性均有正調(diào)控作用。其中，水楊酸處理4h、8h后表達(dá)量逐步上調(diào)，12h表達(dá)量下調(diào)后又逐漸上調(diào)，72h表達(dá)量最高，是對(duì)照的25.6倍。過氧化氫處理4h時(shí)，表達(dá)量上調(diào)3倍，8h時(shí)表達(dá)量下調(diào)，之后保持在較低水平。茉莉酸處理24h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的10.5倍。赤霉素處理4h后表達(dá)量大幅上調(diào)，為對(duì)照的4.1倍，隨后下降。乙烯利處理24h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)，約為對(duì)照表達(dá)量的16倍。脫落酸處理后，基因表達(dá)量逐漸上調(diào)，24h時(shí)達(dá)最高，是對(duì)照的5.4倍，隨后顯著下降。鹽處理4h后表達(dá)量最高，是對(duì)照的4.5倍，隨后又大幅下降，表達(dá)量保持在較低水平。低溫處理后72 h時(shí)，表達(dá)量大幅上調(diào)，為對(duì)照的26倍。干旱處理后12 h時(shí)基因表達(dá)量最高，為對(duì)照的35倍。

圖5 植物GPAT基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic tree of plant GPAT isoforms

圖6 AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生不同組織和種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 Fig.6 Expression analysis of AhGPAT3 and AhGPAT5 in six peanut tissues and at five stages of seed development

圖7 AhGPAT3基因在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)分析 Fig.7 Expression analysis of AhGPAT5 under abiotic stresses

圖8顯示，以0h花生幼苗為對(duì)照，低溫和過氧化氫處理下，表達(dá)量在4 h時(shí)大量下調(diào)，隨后逐漸上調(diào)，72 h時(shí)表達(dá)量最高分別為對(duì)照的1.06倍和1.13倍。AhGPAT5基因在高鹽、低溫和干旱非生物逆境脅迫及激素處理下，表達(dá)量均明顯下調(diào)。表明該基因在非生物脅迫條件下對(duì)花生抗逆性可能具有負(fù)調(diào)控作用。

3 討 論

提高花生含油量及抗逆性研究對(duì)于提高花生產(chǎn)量、緩解我國油料安全具有重要的意義。針對(duì)花生油脂合成代謝的關(guān)鍵基因，對(duì)花生品種進(jìn)行定向改良潛力巨大。GPAT蛋白超家族在植物生長發(fā)育、角質(zhì)、木栓質(zhì)[18]、膜脂和貯存脂質(zhì)的合成中起至關(guān)重要的作用[19]，是TAG生物合成途徑中的限速酶[20]，在植物種子含油量和逆境抗性中有著不可忽視的影響。前人研究表明，擬南芥AtGPAT5基因影響根和種子表皮木栓質(zhì)的合成[21]，在擬南芥和煙草中過量表達(dá)AtGPAT5基因，植物葉片表面出現(xiàn)甘油單酯[18,22-23]。Men等[12]研究發(fā)現(xiàn)水稻中OsGPAT3功能缺失顯著影響花藥角質(zhì)層和花粉外壁的形成，并導(dǎo)致雄性不育。目前，對(duì)于花生AhGPAT3和AhGPAT5基因功能的相關(guān)研究較少。

圖8 AhGPAT5基因不同非生物脅迫條件下的表達(dá)分析 Fig.8 Expression analysis of AhGPAT5 under abiotic stresses

本實(shí)驗(yàn)克隆得到的AhGPAT3和AhGPAT5編碼的蛋白均具有GPAT家族共有的甘油?；D(zhuǎn)移酶保守氨基酸序列(AT-I～AT-IV)[24]。因此推測兩個(gè)基因在功能上可能有與GPAT家族類似的功能，在花生油脂合成過程中起重要作用。AT保守域位于蛋白質(zhì)序列C端。其中AT-I中的組氨酸和天冬氨酸，AT-III中的甘氨酸，AT-IV中的脯氨酸主要起催化作用。AT-II中的精氨酸和AT-III中的谷氨酸(絲氨酸)主要起綁定3-磷酸甘油底物的作用[25]。除了AT保守域，一個(gè)類似鹵酸脫鹵酶(HAD-I～HAD-IV)的保守域在AhGPAT6和AhGPAT8的N末端被發(fā)現(xiàn)。這個(gè)保守域一般存在于磷酸水解酶中。HAD-I含有一個(gè)典型的DXD框，其中天冬氨酸作為催化過程中的親核體。HAD-II中的蘇氨酸和HAD-III中的賴氨酸有利于反應(yīng)中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性。HAD-IV中含有酸性氨基酸天冬氨酸殘基，有利于Mg2+在活性位點(diǎn)的互作[26]。

實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，AhGPAT3和AhGPAT5基因在下胚軸中表達(dá)量最高，說明其可能參與種子萌發(fā)。和小燕等[27]研究表明，花生種子發(fā)育初期，各類調(diào)控脂肪酸合成的基因比較活躍，而隨著合成油脂調(diào)控的不斷繼續(xù)，相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)量下降，同時(shí)各類脂肪酸和油脂的合成也漸漸變慢。AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生種子發(fā)育過程中的表達(dá)量變化符合這一現(xiàn)象，初期表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期，因此，推測兩基因可能參與種子油脂合成。實(shí)驗(yàn)下一步計(jì)劃通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將兩基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥和花生中，闡明兩基因在花生油脂合成和抗逆調(diào)控中的作用機(jī)理。

干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量[28-29]。目前，對(duì)GPAT基因家族在非生物脅迫方面的研究較少。Szalontai等[30]將擬南芥質(zhì)體GPAT基因轉(zhuǎn)入煙草中超表達(dá)能提高其低溫抗性，而將南瓜質(zhì)體GPAT的cDNA轉(zhuǎn)入煙草中超表達(dá)卻降低了煙草的抗寒能力。劉繼梅等[31]對(duì)不同抗冷性水稻品種GPAT保守氨基酸區(qū)域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)不同位點(diǎn)的脯氨酸替換與水稻抗冷性相關(guān)。Sui等[32]在番茄中超表達(dá)LeGPAT基因，提高了其耐低溫能力。在本試驗(yàn)為了探究AhGPAT3和AhGPAT5兩基因是否對(duì)花生各種非生物逆境脅迫和激素處理有響應(yīng)，并可能參與哪些抗性調(diào)節(jié)，以期為花生抗性分子調(diào)控研究提供新的基因資源。設(shè)計(jì)了3種非生物逆境脅迫條件及6種激素處理，進(jìn)行全面調(diào)查。結(jié)果表明，兩基因?qū)Χ喾N非生物逆境脅迫有不同的響應(yīng)模式。AhGPAT3葉片基因受干旱、低溫、高鹽非生物脅迫明顯誘導(dǎo)表達(dá)。低溫處理72 h后的表達(dá)量是對(duì)照的26倍，干旱處理12 h后的表達(dá)量是對(duì)照的35倍，高鹽處理4 h后的表達(dá)量是對(duì)照的4.5倍。因此推測，AhGPAT3基因可能參與了花生非生物脅迫抗性調(diào)節(jié)過程。脅迫響應(yīng)基因可能通過兩種信號(hào)途徑調(diào)控：ABA依賴型和非ABA依賴型。熒光定量PCR結(jié)果表明，在花生葉片中AhGPAT3的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)明顯，推測AhGPAT3以依賴ABA的方式參與非生物脅迫的調(diào)控。

本研究從花生中克隆了AhGPAT3和AhGPAT5兩個(gè)基因。多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，AhGPAT3與高等植物的GPAT3和GPAT2親緣關(guān)系最近；AhGPAT5與高等植物的GPAT5和GPAT7親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果顯示，AhGPAT3和AhGPAT5基因在種子發(fā)育初期和下胚軸中的表達(dá)量較高。另外發(fā)現(xiàn)，AhGPAT3基因在花生耐旱、耐低溫、耐鹽機(jī)制中發(fā)揮重要作用，很可能參與了花生在干旱、低溫和高鹽逆境脅迫條件下的抗性調(diào)節(jié)。