紅麻HcWRKY20基因的克隆與表達(dá)特征分析

潘根，趙立寧，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟，常麗，鄧勇，李德芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它包含一段高度保守的、約60個氨基酸殘基組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其保守的WRKYGQK氨基酸序列位于N端，而C端通常有鋅指結(jié)構(gòu)（Zincfinger motif）。其功能的行使主要是通過與目標(biāo)基因啟動子區(qū)域的W-box結(jié)合來調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)［1］。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)的數(shù)目以及鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被劃分成3類（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子包含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2；Ⅱ、Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)域的類型不同，Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，Ⅲ類為 C2HC［1］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子被大量報道參與植物的生長發(fā)育進(jìn)程、生物脅迫及非生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控［2-5］。在水稻中過表達(dá)OsWRKY53后，株高變高，對水稻褐飛虱的抗性提高，但同時增加了水稻對二化螟的感蟲性［6-8］。在短日照條件下，擬南芥中AtWRKY12和AtWRKY13參與調(diào)控擬南芥開花的途徑［9］。在煙草中異位表達(dá)棉花轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY17能夠提高煙草對鹽和干旱脅迫的耐性［10］。作為植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在大量物種如水稻、擬南芥等作物中被鑒定出來［10-13］。通過分析本實驗室鎘脅迫下紅麻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了一個紅麻轉(zhuǎn)錄因子Hc-WRKY20序列，本研究進(jìn)一步對該基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及不同外界脅迫下的表達(dá)特性研究，旨在為進(jìn)一步解析該基因生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

中紅麻16號為本課題組提供。挑選籽粒飽滿的種子，待種子發(fā)芽后，移入1/2Hoag-land營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔3 d更換營養(yǎng)液。

待紅麻長至4葉1心時進(jìn)行如下處理：外源激素處理：分別對紅麻葉片進(jìn)行外源10 mmol/L水楊酸（SA）和1 mol/L油菜素內(nèi)酯（BR）噴施，不含上述激素的水溶液為空白對照，待噴施6 h后，分別對其葉片取樣用于RNA提取，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)3棵幼苗，SA和BR分別溶于純酒精中，然后稀釋成相應(yīng)濃度的工作液；鹽脅迫處理：4葉1心的紅麻幼苗種植于50 mmol/L NaCl的1/2Hoag-land營養(yǎng)液中，處理2 d后，取紅麻根部用于RNA提??；鎘脅迫處理：4葉1心的紅麻幼苗種植于25 mmol/L CdCl2的1/2Hoag-land營養(yǎng)液中，處理2 d后，取紅麻根部用于RNA提取。

1.2 引物設(shè)計

參考紅麻轉(zhuǎn)錄組序列信息，利用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計，序列由擎科生物技術(shù)公司合成?；蚩寺〉囊镄蛄校篜rimer-F（5’-3’）：ATGCTGTGCCAAGTAACTTG；Primer-R（5’-3’）：TTATGGACCTGTTAGTACTCT。

1.3 RNA提取

參照植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根生化有限公司）的說明書提取總RNA，其完整性和純度用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 HcWRKY20的克隆

提取紅麻幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10×LAPCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，LA Taq（TaKaRa）0.25μL，dNTP（2.5 mmol/mL）1μL，F(xiàn)-primer（10 mol/mL）0.25μL，R-Primer（10 mol/mL）0.25μL，cDNA 1μL，dH2O補足至25μL。反應(yīng)程序：94℃2 min；98℃30 s，55℃30 s，68℃60 s，30個循環(huán)；68℃10 min，反應(yīng)終止于10℃，反應(yīng)結(jié)束后，取20μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對目標(biāo)片段進(jìn)行割膠回收，其PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.5 HcWRKY20的生物信息學(xué)分析

對紅麻鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表）中Unigene的注釋進(jìn)行“WRKY”關(guān)鍵詞搜索，利用BioEdit獲得HcWRKY20轉(zhuǎn)錄組序列信息。進(jìn)一步通過BioXM 2.0（黃驥，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)）尋找該基因的最大開放閱讀框，并利用該軟件預(yù)測其氨基酸序列。在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中對HcWRKY20進(jìn)行氨基酸序列比對（BlastP），利用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹，分析該基因的進(jìn)化關(guān)系。利用PSORT Prediction（https：//psort.hgc.jp/）預(yù)測其蛋白亞細(xì)胞定位情況，同時用ExPASy（www.expasy.ch/tools/pi_tool.html1）分析其蛋白質(zhì)的分子量及等電點。

1.6 HcWRKY20在不同脅迫及外源激素處理下表達(dá)量分析

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）研究HcWRKY20在不同處理下的表達(dá)特征。通過Primer 5.0設(shè)計目的基因引物，F(xiàn)（5’-3’）：CTGCTGCGTGTTCTAATGCT；Primer-R（5’-3’）：GGCGTCTCATGATCCGAAAG；內(nèi)參引物為 actin，引物序列為：F（5’-3’）：ATCCTCCGTCTTGACCTTG；Primer-R（5’-3’）：TGTCCGTCAGGCAACTCAT。qRT-PCR反應(yīng)體系為（20μL）：2×SYBR qPCR Mix 10μL，正向和反向引物各1μL，cDNA為2μL，ddH2O為6μL，反應(yīng)程序為：94℃2 min，94℃10 s，60℃34 s，40個循環(huán)，根據(jù)CT值，采用2-△△CT分別計算出目標(biāo)基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA的提取與質(zhì)量檢測

利用天根植物總RNA試劑盒提取紅麻幼苗總RNA，然后用1%瓊脂糖檢測RNA質(zhì)量。如圖1所示，核糖體28S、18SRNA條帶清晰，且28S條帶亮度約為18S的兩倍，表明RNA結(jié)構(gòu)完整，無污染和降解，可用于后續(xù)試驗。

2.2 HcWRKY20的克隆

以紅麻鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄組獲得HcWRKY20的序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5.0設(shè)計的特異性引物，以紅麻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行檢測，其結(jié)果如圖2所示。對目標(biāo)片段進(jìn)行割膠回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后，挑選陽性單克隆送湖南擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。獲得的序列在NCBI網(wǎng)站通過Blast比對發(fā)現(xiàn)與其他物種中WRKY20基因高度同源，所以該基因命名為HcWRKY20。

圖1 1%瓊脂糖檢測RNA質(zhì)量Fig.1 Detection of RNA quality by 1%agarose gel electrophoresis

圖2 HcWRKY20 CDS全長片段Fig.2 The CDSfull length fragment of HcWRKY20

2.3 HcWRKY20的生物信息學(xué)分析

利用BioXM 2.7對測序所獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框（ORF）預(yù)測，由圖3可知，其全長為1512 bp，推測其編碼503個氨基酸，等電點為7.33，分子量為55.77 KD。蛋白保守結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，HcWRKY20分別在162-168位和282-294位氨基酸包含一段高度保守的WRKYGQK七肽序列，同時含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)（見圖3）。上述結(jié)果表明，HcWRKY20屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，HcWRKY20在326-332含有一段核定位信號基序（DDPFSKRRKMDGW），主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，可能在細(xì)胞核中行使轉(zhuǎn)錄激活/抑制功能。

圖3 HcWRKY20全長ORF序列及氨基酸序列Fig.3 Full-length ORF sequence and amino acid sequence of HcWRKY20

將該基因編碼的氨基酸在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BlastP比對發(fā)現(xiàn)，該基因氨基酸序列與雷蒙德氏棉、陸地棉、二倍體棉、可可、榴蓮以及哥倫比亞錦葵中WRKY20序列具有較高的相似性，其同源性高達(dá)70%以上。進(jìn)一步利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建了HcWRKY20系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖4），結(jié)果表明紅麻HcWRKY20與雷蒙德氏棉、陸地棉、二倍體棉親緣關(guān)系較近，與可可、哥倫比亞錦葵親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 紅麻HcWRKY20基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of HcWRKY20 gene in kenaf

2.4 HcWRKY20表達(dá)特征分析

2.4.1 HcWRKY20在不同的組織表達(dá)特異性分析

為了更好的了解HcWRKY20的生理功能，對HcWRKY20在苗期的不同組織（根、莖、葉）中進(jìn)行了表達(dá)水平的分析。如圖5A所示，HcWRKY20在不同組織中表達(dá)量存在差異，在根和葉中表達(dá)量較高，而在莖中表達(dá)量較低，暗示該基因可能主要在根和葉中發(fā)揮功能。

2.4.2 NaCl等非生物脅迫下HcWRKY20基因表達(dá)分析

如圖5B所示，外源NaCl及重金屬鎘脅迫處理兩天后，HcWRKY20的表達(dá)水平均顯著高于對照處理。尤其在NaCl脅迫處理2 d時，HcWRKY20的表達(dá)量水平約為對照處理的8倍。上述結(jié)果表明，非生物脅迫（Cd和NaCl）能夠誘導(dǎo)HcWRKY20基因的表達(dá)。

2.4.3 外源油菜素內(nèi)酯（BR）、水楊酸（SA）處理后表達(dá)分析

前人研究［5，14］表明，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子受到BR和SA誘導(dǎo)表達(dá)。如圖5C所示，外源SA處理6 h后，HcWRKY20受到顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，而外源BR噴施6 h后，HcWRKY20的表達(dá)水平受到顯著的抑制。

圖5 HcWRKY20基因不同組織及外源處理下表達(dá)水平分析Fig.5 Expression level analysis of HcWRKY20 in different tissues under different exogenous treatment in kenaf

3 討論

紅麻（Hibcus cɑnnɑbinus L.）是錦葵科木槿屬一年生速生纖維作物，適應(yīng)性廣，被廣泛地用于造紙、墻布、麻地膜、飼料等方面。關(guān)于紅麻基因的分離、鑒定和克隆報道較少。通過RACE技術(shù)從紅麻質(zhì)核互作雄性不育系中克隆了紅麻atp1基因［14］?；诒緦嶒炇益k脅迫下紅麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，本研究從高產(chǎn)多抗紅麻品種“中紅麻16號”中克隆HcWRKY20基因。該基因全長為1512 bp，推測其編碼503個氨基酸，包含兩個保守的WRKYGQK七肽序列，屬于Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。HcWRKY20為紅麻第一個被克隆的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其在紅麻生長、發(fā)育及外界脅迫中的作用需進(jìn)一步研究。

為了探究HcWRKY20潛在的生物學(xué)功能，本研究分析該基因在外源激素和不同生物脅迫下表達(dá)情況。外源SA處理能夠誘導(dǎo)HcWRKY20的表達(dá)，而BR抑制該基因的表達(dá)，暗示SA與BR以拮抗方式調(diào)控HcWRKY20表達(dá)，該研究結(jié)果與前人［15］在水稻中的研究結(jié)果類似。本研究同時也發(fā)現(xiàn)外源Cd和NaCl處理能夠顯著誘導(dǎo)HcWRKY20的表達(dá)。前人研究［16］表明，大豆GmWRKY20基因受到鹽、冷害及干旱誘導(dǎo)，且在擬南芥中異位表達(dá)該基因能夠顯著提高擬南芥對干旱的耐性；在苜蓿中過表達(dá)野生大豆GsWRKY20能夠顯著提高苜蓿對干旱和鹽脅迫的耐受性［17］，HcWRKY20是否參與調(diào)控植物干旱脅迫還待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)HcWRKY20受外源逆境相關(guān)激素SA和脅迫（Cd、NaCl）誘導(dǎo)表達(dá)，暗示該基因可能參與調(diào)控植物逆境脅迫反應(yīng)。后期研究中需通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒烌炞CHcWRKY20在紅麻逆境脅迫中的生物學(xué)功能。