不同大麻品種種子萌發(fā)期耐重金屬銅脅迫能力評(píng)價(jià)

張亞娟，王倩，龍瑜菡，李璇，李光菊，鄧綱，劉飛虎

（云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明650091）

大麻（Cɑnnɑbis sɑtivɑL.）為大麻科、大麻屬一年生草本綠色纖維植物，大麻可密植、生物量大、生長(zhǎng)快。大麻纖維可制成許多高檔紡織品，植株全桿可替代木材造紙、制造建筑材料，大麻籽可作為食品、藥品和飼料，大麻籽榨出的油還可作為化工原料、燃料，大麻的根、花、葉、種子皆可制成藥品，葉、枝梢、果殼皆可作為良好的殺蟲防病的土壤肥料［1-2］，故大麻已成為當(dāng)今適應(yīng)社會(huì)綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)需求的綠色經(jīng)濟(jì)作物之一。

近年來，隨著城市現(xiàn)代化、工業(yè)化的發(fā)展，以及化肥濫用等現(xiàn)象加劇，土壤重金屬銅進(jìn)入環(huán)境而導(dǎo)致的污染不斷惡化，尤其通過食物鏈對(duì)動(dòng)植物以及人類產(chǎn)生重大危害［3-4］。因此，解決重金屬銅污染問題已是當(dāng)今環(huán)境可持續(xù)發(fā)展和人類綠色健康需求的迫切問題。篩選、培育出吸收銅能力強(qiáng)、生物量大、生長(zhǎng)快、且不進(jìn)入食物鏈的植物是生物修復(fù)的一項(xiàng)重要任務(wù)［5］。有研究［6-7］表明，大麻已成為修復(fù)重金屬污染土壤的候選植物之一，其具有生長(zhǎng)快，生物量大，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特點(diǎn)。作物的萌發(fā)期是生長(zhǎng)起始階段，直接關(guān)系到以后的生長(zhǎng)發(fā)育。前人［8-9］對(duì)萌發(fā)期的“云麻2號(hào)”進(jìn)行4種重金屬（Cu、Zn、Pb、Cd）處理，發(fā)現(xiàn)云麻2號(hào)對(duì)這4種重金屬的抗性不同，還發(fā)現(xiàn)萌發(fā)期不同品種大麻耐鉛性有差異。但由于現(xiàn)今大麻品種繁雜，品種間耐重金屬差異顯著，缺乏科學(xué)系統(tǒng)的重金屬銅耐性評(píng)價(jià)體系，進(jìn)而嚴(yán)重影響大麻耐銅品種選育、生物修復(fù)備選經(jīng)濟(jì)作物推廣，故進(jìn)行大麻耐銅性評(píng)價(jià)具有重要的科學(xué)實(shí)踐意義。因此，本研究開展了大麻萌發(fā)期重金屬銅耐性研究。

本試驗(yàn)針對(duì)重金屬銅污染問題，對(duì)不同品種萌發(fā)期大麻進(jìn)行不同濃度銅（Cu2+）處理，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)量，以隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)不同品種間的耐銅性差異，旨在為篩選耐銅大麻品種以及利用大麻作物修復(fù)重金屬銅污染土壤提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣西的巴馬火麻（BM）、云南的云麻 1號(hào)（Y1）、云麻5號(hào)（Y5）、云麻6號(hào)（Y6）、云麻 7號(hào)（Y7）、云晚6號(hào)（YW6）、安徽的皖麻1號(hào)（W1）、山西的晉麻1號(hào)（J1）和黑龍江的慶麻1號(hào)（Q1）9個(gè)大麻品種。

1.2 試驗(yàn)方法

銅離子 Cu2+（CuSO4·5H2O）濃度設(shè)置為0（CK）、50、100、150、300、600、900 mg/L。

先將9個(gè)大麻品種種子用蒸餾水沖洗干凈表皮，然后用吸水紙吸干大麻種子表面水分，再挑選外型優(yōu)良一致的30粒種子均勻置于培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)，最上面鋪一層濾紙，下鋪三層吸水紙，加入15 mL 7個(gè)不同濃度梯度的銅溶液，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將培養(yǎng)皿置于25℃光照培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3 d進(jìn)行催芽；后4 d置于光照12 h/d、光強(qiáng)8000 lx、光照期溫度25℃，黑暗期12 h/d、溫度20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，由于每天水分蒸發(fā)，期間補(bǔ)充重金屬溶液，以保持發(fā)芽水分和重金屬銅的質(zhì)量濃度。以胚根長(zhǎng)大于大麻種子長(zhǎng)度一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)［10］，每天觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)，共統(tǒng)計(jì)7 d，第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)；第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長(zhǎng)（主根）、芽長(zhǎng)、鮮重，計(jì)算根長(zhǎng)抑制指數(shù)（主根）、芽長(zhǎng)抑制指數(shù)，以側(cè)根長(zhǎng)≥0.5 mm統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)量［11］。

相關(guān)計(jì)算公式如下［12-13］：

其中：GI：發(fā)芽指數(shù)；Gt：指定時(shí)間（天）的發(fā)芽種子數(shù)；Dt：相應(yīng)的發(fā)芽試驗(yàn)時(shí)間（天）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)中各數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行記錄統(tǒng)計(jì)，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素（Duncan法）方差分析，用Excel 2010軟件制作圖表。

1.4 不同大麻品種耐銅性綜合評(píng)價(jià)

對(duì)9個(gè)大麻品種進(jìn)行耐銅性評(píng)價(jià)。首先將各項(xiàng)指標(biāo)值換算成相對(duì)值（相對(duì)值=處理值/對(duì)照值），然后按下面公式計(jì)算隸屬函數(shù)值。如果各指標(biāo)相對(duì)值與大麻耐性呈正相關(guān)，就代入（6）式進(jìn)行計(jì)算，反之則代入（7）式進(jìn)行計(jì)算。將各品種大麻各指標(biāo)的耐性隸屬函數(shù)值累加起來，求其平均值［14-15］。

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為：

式中：xij表示i品種j個(gè)相對(duì)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；xj為第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；xjmax和xjmin分別表示所有品種第j個(gè)相對(duì)指標(biāo)的最大值和最小值；再根據(jù)平均隸屬函數(shù)X值的大小對(duì)9個(gè)品種進(jìn)行耐性鑒定，即X≥0.7為1級(jí)高耐型，0.50≤X≤0.70為2級(jí)中耐型，0.30≤X<0.50為3級(jí)低耐型，X<0.3為 4級(jí)不耐型［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對(duì)不同大麻品種種子萌發(fā)的影響

2.1.1 銅脅迫對(duì)大麻發(fā)芽勢(shì)的影響

由表1可看出，除Y6、Y7、W1在低濃度發(fā)芽勢(shì)有所增加外，其余品種發(fā)芽勢(shì)隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)大麻發(fā)芽勢(shì)抑制效果顯著。Y6、W1、Y7在銅濃度為50 mg/L時(shí)較之對(duì)照發(fā)芽勢(shì)升高，其中Y6、Y7在銅濃度至100 mg/L時(shí)發(fā)芽勢(shì)仍較之對(duì)照上升或差異不顯著，但Y6、W1、Y7的發(fā)芽勢(shì)隨著銅濃度高于150 mg/L時(shí)皆較之對(duì)照顯著下降，表現(xiàn)為“低促高抑”現(xiàn)象。其余6個(gè)品種發(fā)芽勢(shì)隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，且與對(duì)照差異顯著。

表1 不同濃度銅對(duì)大麻發(fā)芽勢(shì)的影響Tab.1 Effects of different Cu2+concentration on the germination energy of hemp seeds %

2.1.2 銅脅迫對(duì)大麻發(fā)芽率的影響

由表2可看出，除Y6、Y7在低濃度發(fā)芽率有所增加外，其余品種發(fā)芽率隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)9個(gè)大麻品種發(fā)芽率抑制效果顯著。Y6在銅濃度50、100 mg/L時(shí)較之對(duì)照發(fā)芽率有所增加，Y7在銅濃度50 mg/L時(shí)較之對(duì)照發(fā)芽率增加且差異顯著，而后Y6、Y7發(fā)芽率隨著銅濃度的增加而下降。當(dāng)銅濃度為50 mg/L時(shí)，Q1、Y1發(fā)芽率顯著低于對(duì)照，J1、W1、Y5、YW6在銅濃度100 mg/L時(shí)發(fā)芽率開始顯著低于對(duì)照，Y6、Y7在銅濃度為150 mg/L時(shí)發(fā)芽率開始顯著低于對(duì)照。

表2 不同濃度銅對(duì)大麻發(fā)芽率的影響Tab.2 Effects of different Cu2+concentration on the germination rate of hemp seeds %

2.1.3 銅脅迫對(duì)大麻發(fā)芽指數(shù)的影響

由表3可看出，除Y6、Y7在低濃度50 mg/L、100 mg/L發(fā)芽指數(shù)較之對(duì)照有所增加外，其余品種發(fā)芽指數(shù)隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)大麻發(fā)芽指數(shù)抑制效果顯著。BM、Y1、Q1在所有銅濃度下發(fā)芽指數(shù)皆顯著低于對(duì)照；Y6、J1、W1、Y5、Y7、YW6在銅濃度為50 mg/L時(shí)與對(duì)照差異不顯著，可見 Y6、J1、W1、Y5、Y7、YW6對(duì)低濃度銅有一定耐性。

表3 不同濃度銅對(duì)大麻發(fā)芽指數(shù)的影響Tab.3 Effects of different Cu2+concentration on the germination index of hemp seeds

2.1.4 銅脅迫對(duì)大麻活力指數(shù)的影響

由表4可看出，除Y7在低濃度活力指數(shù)較之對(duì)照有所增加外，其他品種大麻活力指數(shù)總體隨著銅濃度的上升呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)9個(gè)大麻品種活力指數(shù)抑制效果顯著。除Y7在銅濃度50 mg/L時(shí)活力指數(shù)顯著高于對(duì)照外，其余8個(gè)品種在銅濃度50 mg/L時(shí)活力指數(shù)顯著低于對(duì)照。

2.2 銅脅迫對(duì)大麻芽苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 銅脅迫對(duì)大麻根長(zhǎng)的影響

由表5可看出，各個(gè)大麻品種的根長(zhǎng)均隨著銅濃度的上升呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)根長(zhǎng)抑制效果顯著。供試大麻品種在各銅濃度下根長(zhǎng)均低于對(duì)照，彼此間差異顯著。Q1在50～900 mg/L濃度范圍內(nèi)受抑制效果無(wú)顯著差別，說明50 mg/L即對(duì)Q1表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，以至于再增加濃度后抑制空間不大。

表4 不同濃度銅對(duì)大麻活力指數(shù)的影響Tab.4 Effects of different Cu2+concentration on the vigor index of hemp seeds

表5 不同濃度銅對(duì)根長(zhǎng)（主根）的影響Tab.5 Effects of different Cu2+concentration on the radice length of hemp germination cm

2.2.2 銅脅迫對(duì)大麻芽長(zhǎng)的影響

由表6可看出，各個(gè)大麻品種的芽長(zhǎng)總體隨銅濃度的上升呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)9個(gè)大麻品種芽長(zhǎng)的抑制效果。J1在銅濃度50 mg/L時(shí)芽長(zhǎng)較對(duì)照顯著增加，說明低濃度對(duì)J1的芽長(zhǎng)有促進(jìn)作用，Y7芽長(zhǎng)在銅濃度50 mg/L、100 mg/L時(shí)與對(duì)照差異不顯著，可見J1、Y7有一定的耐銅性；BM、Y1、Y6、W1、Y5、Q1、YW6在低銅濃度50 mg/L時(shí)芽長(zhǎng)皆顯著低于對(duì)照?？傮w上可見高銅濃度600～900 mg/L對(duì)芽長(zhǎng)強(qiáng)烈抑制，使之難有下降空間，同時(shí)同一品種的芽長(zhǎng)對(duì)不同銅濃度處理反應(yīng)有所差異，不同品種之間的芽長(zhǎng)對(duì)同一銅濃度處理反應(yīng)有所差異。

2.2.3 重金屬銅對(duì)大麻芽苗根長(zhǎng)與芽長(zhǎng)抑制指數(shù)的差異性的影響

由表7可知，總體上隨著銅濃度增加根長(zhǎng)抑制指數(shù)、芽長(zhǎng)抑制指數(shù)增加，9個(gè)大麻品種各處理濃度根長(zhǎng)抑制指數(shù)大于芽長(zhǎng)的抑制指數(shù)，說明銅脅迫對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用比對(duì)芽長(zhǎng)強(qiáng)。在銅濃度為600 mg/L時(shí)根長(zhǎng)抑制指數(shù)與芽長(zhǎng)抑制指數(shù)都高達(dá)0.7以上，J1在低銅濃度50 mg/L時(shí)芽長(zhǎng)抑制指數(shù)為-0.18，而后隨脅迫增加芽長(zhǎng)受抑制，可見低銅濃度對(duì)J1芽長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

表6 不同濃度銅對(duì)芽長(zhǎng)的影響Tab.6 Effects of different Cu2+concentration on the hypocotyl length of hemp germination cm

表7 不同濃度銅對(duì)大麻品種根長(zhǎng)（主根）、芽長(zhǎng)抑制指數(shù)的影響Tab.7 Effects of different Cu2+concentration on the inhibition index of root and shoot length of 9 varieties

2.2.4 銅脅迫對(duì)大麻芽苗鮮重的影響

由表8可知，各個(gè)品種鮮重都隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)9個(gè)大麻品種鮮重抑制效果顯著。當(dāng)銅濃度≥50 mg/L時(shí)，BM、Y1、Y6、W1、Y5、Q1、Y7、YW6鮮重不斷減少且顯著低于對(duì)照，J1在銅濃度50～150 mg/L時(shí)鮮重與對(duì)照差異不顯著，當(dāng)銅濃度≥300 mg/L時(shí)顯著低于對(duì)照。

表8 銅濃度對(duì)芽苗鮮重的影響Tab.8 Effects of different Cu2+concentration on the fresh weight of hemp germination g/10株

2.2.5 銅脅迫對(duì)大麻芽苗側(cè)根數(shù)量的影響

如表9所示，各個(gè)品種側(cè)根數(shù)量隨著銅濃度增加呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出銅對(duì)9個(gè)大麻品種側(cè)根數(shù)抑制效果顯著。各個(gè)品種在銅濃度為50 mg/L時(shí)側(cè)根數(shù)顯著低于對(duì)照，在銅濃度600 mg/L已無(wú)側(cè)根產(chǎn)生。

表9 不同濃度銅對(duì)側(cè)根數(shù)量的影響Tab.9 Effects of different Cu2+concentration on the lateral root number of hemp germination

2.3 不同大麻品種銅耐性評(píng)價(jià)

選擇對(duì)大麻發(fā)芽、根、芽、側(cè)根生長(zhǎng)具有顯著限制性作用的銅濃度（600 mg/L），以相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)芽長(zhǎng)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用隸屬函數(shù)法對(duì)各品種耐銅性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表10所示。根據(jù)隸屬函數(shù)的大小，得到9個(gè)品種銅耐性強(qiáng)弱：Y6>YW6>Y7>J1>Y5>W1>BM>Y1>Q1。

根據(jù)隸屬函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)分類結(jié)果如下（表11），得到9個(gè)品種銅耐性強(qiáng)弱：Y7、Y6、YW6為高耐銅型，J1、Y5、W1為中耐銅型，BM、Y1、Q1為低耐銅型。

表10 銅（600 mg/L）脅迫下大麻各相對(duì)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Tab.10 The subordinative values of relative values germination indexes under Cu2+

表11 9個(gè)大麻品種的平均隸屬函數(shù)銅耐型分類Tab.11 Average membership function tolerance classification for 9 varieties

3 討論與總結(jié)

本試驗(yàn)中隨著銅濃度的增加，9個(gè)大麻品種的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)總體呈下降趨勢(shì)，特別是高濃度銅脅迫對(duì)大麻萌發(fā)抑制作用強(qiáng)烈，該研究結(jié)果與張文娟等［16］發(fā)現(xiàn)高濃度重金屬銅脅迫抑制萌發(fā)過程相一致。原因可能是銅抑制了種子萌發(fā)所需要的淀粉酶和蛋白酶的活性，降低了貯存物質(zhì)的分解速度，導(dǎo)致種子萌發(fā)所需物質(zhì)和能量的供給受阻，從而降低了萌發(fā)率［17-18］。

隨著銅濃度的增加，9個(gè)大麻品種的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重、側(cè)根數(shù)量顯著低于對(duì)照，重金屬銅對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用比芽長(zhǎng)抑制作用大，表明銅對(duì)9個(gè)大麻品種萌發(fā)期的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)烈且對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用比芽長(zhǎng)大，與王翰等［19］的試驗(yàn)結(jié)果一致?？赡茉蚴欠N子萌發(fā)胚根最先突破種皮吸水，使胚根的重金屬累積量以及受脅迫時(shí)間比胚芽大，重金屬離子被根尖細(xì)胞吸收并累積，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生自由基［20-21］，當(dāng)自由基產(chǎn)生量超過根系自身的抗氧化酶的清除能力時(shí)，就會(huì)對(duì)根系產(chǎn)生傷害，使根系活力下降［22］，植物根部損傷嚴(yán)重，主根伸長(zhǎng)受到抑制，根尖出現(xiàn)硬化，生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞分裂受到抑制，根毛數(shù)量減少甚至枯死［23］。同時(shí)，根系生長(zhǎng)受到抑制后，胚芽的生長(zhǎng)、鮮重均發(fā)生不同程度的下降，其中以根長(zhǎng)下降最為劇烈。不同大麻品種對(duì)高濃度銅脅迫的表現(xiàn)不盡相同，在一定程度上出現(xiàn)分化，各個(gè)品種基因的差異導(dǎo)致耐性不同［24］，是基因與環(huán)境的綜合表現(xiàn)［9］。本研究采用隸屬函數(shù)法對(duì)大麻品種進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，消除了個(gè)別指標(biāo)帶來的片面性，用隸屬函數(shù)法將本次所選9個(gè)大麻品種分為3種不同耐銅型大麻品種。

由于植物生長(zhǎng)發(fā)育在萌發(fā)期和苗期所需條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，應(yīng)對(duì)脅迫方式可能存在差異，萌發(fā)期耐性不能完全代表植物總體耐性，最好結(jié)合某些物種苗期耐性進(jìn)行跟蹤試驗(yàn)，同時(shí)開展重金屬?gòu)?fù)合影響試驗(yàn)，以及進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)理，從而指導(dǎo)實(shí)踐。