早期二甲雙胍治療對糖尿病前期合并短暫局灶腦缺血后長期認(rèn)知功能的影響

黎潔潔，彭玉晶，王擁軍

既往的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明卒中和糖尿病可增加阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。本課題組前期使用短暫局灶腦缺血或2型糖尿病動(dòng)物模型的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物具有AD樣改變，包括認(rèn)知功能障礙，腦內(nèi)Aβ或磷酸化tau蛋白的增加[4-5]。糖尿病作為卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可加劇卒中引起的認(rèn)知功能障礙[6]。糖尿病前期包括空腹血糖受損和糖耐量異常[7]。卒中患者中，約1/3合并糖尿病前期[8]。糖尿病前期同樣可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[9]。雖如此，糖尿病前期對卒中后認(rèn)知功能的影響仍不清楚。二甲雙胍被推薦用于糖尿病前期患者預(yù)防糖尿病的發(fā)生[7]。本課題組前期研究表明，二甲雙胍可減輕糖尿病鼠顱內(nèi)AD樣的病理改變[5]，而本次研究將分析二甲雙胍對糖尿病前期合并短暫局灶腦缺血大鼠認(rèn)知功能的影響。

1 研究對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飲食 6周齡雄性Wistar大鼠接受高脂飲食（60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)，貨號D12492i，美國Research Diet公司）制作糖尿病前期模型，或與高脂飲食的膽固醇/糖含量匹配的正常對照飲食（10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)，美國Research Diet公司）。首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷委員會(huì)同意所有實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn) 分別在10周齡和14周齡時(shí)通過腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)的方法評估是否出現(xiàn)糖尿病前期[9]。大鼠禁食12 h后，腹腔注射葡萄糖（2 g/kg），2 h后尾靜脈采血，通過血糖檢測試紙（拜耳）檢測血糖值。

1.3 短暫大腦中動(dòng)脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion，MCAO） MCAO方法如前所述[4]，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉14周齡的雄性Wistar大鼠。通過電加熱毯將動(dòng)物體溫控制在（37±0.5）℃。將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至稍有阻力時(shí)停止，90 min后拔除拴線。

1.4 二甲雙胍治療和生化指標(biāo)檢測 高脂飲食喂養(yǎng)4周后將動(dòng)物隨機(jī)分成二甲雙胍治療組[200 mg/（kg·d），腹腔注射[5]]和生理鹽水治療對照組。每2周稱量動(dòng)物體重以調(diào)整藥物治療劑量。22周齡時(shí)通過血糖檢測試紙（拜耳）進(jìn)行空腹血糖檢測；14周齡和22周齡時(shí)通過ELISA的方法檢測血清空腹胰島素濃度（貨號EZRMI-13K，Millipore公司）。

1.5 Rotarod旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 分別在15、20周齡時(shí)進(jìn)行Rotarod旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評估運(yùn)動(dòng)功能。如前所述[4]，讓動(dòng)物站在轉(zhuǎn)軸上1 min以熟悉滾動(dòng)軸裝置及周圍環(huán)境。然后開始訓(xùn)練動(dòng)物在轉(zhuǎn)軸上學(xué)習(xí)行走：設(shè)定轉(zhuǎn)軸為加速運(yùn)動(dòng)，5 min內(nèi)速度從4 rpm勻速加速到40 rpm，當(dāng)動(dòng)物從轉(zhuǎn)軸上掉落下來之后停止實(shí)驗(yàn)。每天連續(xù)3次，每次間隔15 min，持續(xù)2 d。第3天開始正式測試。同樣設(shè)定轉(zhuǎn)軸5 min內(nèi)速度從讓動(dòng)物接受轉(zhuǎn)速4 rpm勻速加速到40 rpm。記錄動(dòng)物從轉(zhuǎn)軸上掉下來時(shí)的時(shí)間和轉(zhuǎn)軸的速度。速度-時(shí)間指數(shù)=時(shí)間（s）×速度（rpm）。

1.6 Morris水迷宮 動(dòng)物在21周齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評估認(rèn)知功能[10]。參照迷宮（直徑160 cm，高度50 cm）的中心將水迷宮分為四個(gè)象限。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為平臺(tái)不可視實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)。在平臺(tái)不可視實(shí)驗(yàn)中，逃離平臺(tái)（直徑12 cm，高度28 cm）固定置于第四象限中央，距離水面2 cm。平臺(tái)不可視實(shí)驗(yàn)包括連續(xù)5 d的訓(xùn)練期。在訓(xùn)練期中，每天接受3次訓(xùn)練，每次間隔15 min。每次訓(xùn)練的時(shí)候，動(dòng)物依次順時(shí)針從四個(gè)象限放入水池，動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)后當(dāng)次訓(xùn)練結(jié)束，如果時(shí)間超過2 min無法到達(dá)平臺(tái)，當(dāng)次訓(xùn)練終止，將動(dòng)物引導(dǎo)到逃離平臺(tái)，并讓動(dòng)物在平臺(tái)逗留30 s，隨后擦干放入籠中。所有訓(xùn)練期結(jié)束后的第2天進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)。整個(gè)探索實(shí)驗(yàn)持續(xù)2 min。在探索實(shí)驗(yàn)中，第四象限的平臺(tái)將被撤離，同時(shí)記錄動(dòng)物在第四象限逗留的時(shí)間。通過水迷宮上方的攝像頭和迷宮軟件（上海濟(jì)良軟件技術(shù)公司）記錄分析動(dòng)物游泳路線和時(shí)間。實(shí)驗(yàn)人員將進(jìn)行盲法操作。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食可誘導(dǎo)糖尿病前期 持續(xù)4周的高脂飲食即可引起糖耐量異常和體重增加，持續(xù)到8周時(shí)，這種改變更加明顯，同時(shí)還出現(xiàn)血清胰島素含量增加（表1），說明高脂飲食可誘導(dǎo)糖尿病前期的發(fā)生。

2.2 糖尿病前期對卒中后運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的影響和正常飲食組相比，糖尿病前期大鼠的運(yùn)動(dòng)功能受損。糖尿病前期合并MCAO后，長期運(yùn)動(dòng)功能變差，但和正常飲食組相比，糖尿病前期并沒有影響MCAO術(shù)后短期的運(yùn)動(dòng)功能（表2）。在認(rèn)知功能方面，所有動(dòng)物隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，到達(dá)平臺(tái)時(shí)間逐漸縮短。然而，MCAO大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間多于對照組，這與探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似（表3）。同時(shí)，在探索實(shí)驗(yàn)中，無MCAO的動(dòng)物逗留在第四象限的時(shí)間更多（表4）。而與MCAO組相比，糖尿病前期合并MCAO的大鼠在第四象限逗留的時(shí)間更短（表4），提示這些動(dòng)物空間記憶能力受損。另外，如表3所示，在到達(dá)平臺(tái)速度方面，有或無MCAO大鼠結(jié)果類似。

2.3 二甲雙胍治療對糖尿病前期合并MCAO的認(rèn)知功能的影響 所有動(dòng)物同樣具有空間學(xué)習(xí)記憶能力。二甲雙胍治療組找到平臺(tái)的時(shí)間更短（表5）。

但在探索實(shí)驗(yàn)中，兩組動(dòng)物逗留在第四象限的時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。兩組動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)速度無差異（表5）。

表1 高脂飲食對生化指標(biāo)的影響

表2 Rotarod旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)各組速度-時(shí)間指數(shù)

2.4 二甲雙胍對生化指標(biāo)的影響 二甲雙胍治療可降低空腹血糖，并且有降低空腹胰島素水平的趨勢（表7），提示二甲雙胍治療改善認(rèn)知功能可能與改善糖尿病前期狀態(tài)有關(guān)。

3 討論

卒中后認(rèn)知功能障礙是臨床中常見的問題。糖尿病是缺血性腦血管病最常見的合并癥之一，并且和認(rèn)知功能相關(guān)[11]。糖尿病前期是介于正常糖代謝和糖尿病之間的中間狀態(tài)，提示發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加[12-13]。既往流行病學(xué)研究表明，約1/3無糖尿病史的缺血性腦血管病患者合并糖尿病前期[14]。更重要的是，糖尿病前期患者不僅是發(fā)生糖尿病和卒中的高危人群，也更容易發(fā)生認(rèn)知功能障礙[15-17]。本研究通過高脂飲食成功建立糖尿病前期的動(dòng)物模型，表現(xiàn)為糖耐量異常、肥胖和胰島素水平增加。和本課題組既往研究結(jié)果一致，短暫局灶腦缺血損害了認(rèn)知功能[4]。而本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起的糖尿病前期加劇了缺血性卒中引起的長期認(rèn)知功能障礙。

表3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

雖然所有動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間逐漸縮短，說明不管是否有糖尿病前期或MCAO，所有動(dòng)物都具有空間學(xué)習(xí)記憶能力，然而不管在訓(xùn)練期還是探索實(shí)驗(yàn)中，糖尿病前期合并MCAO大鼠找到平臺(tái)時(shí)間更長，說明其空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。臨床數(shù)據(jù)表明，糖尿病前期是卒中不良結(jié)局的危險(xiǎn)因素[14]，MCAO術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能障礙可能影響水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但本研究結(jié)果表明，無論有無MCAO的大鼠，其到達(dá)平臺(tái)速度無明顯差異，提示水迷礙[20]，而其他研究卻發(fā)現(xiàn)接受二甲雙胍治療的糖尿病患者其癡呆風(fēng)險(xiǎn)明顯降低[21-22]。尸檢的結(jié)果也間接證實(shí)了二甲雙胍治療可以改善AD相關(guān)的神經(jīng)病理改變[23]。研究人群差異，研究設(shè)計(jì)不同和糖尿病的嚴(yán)重程度差異可能是上述臨床研究結(jié)論不同的原因。在實(shí)驗(yàn)室研究方面，既往研究表明，二甲雙胍可通過促進(jìn)神經(jīng)再生改善空間學(xué)習(xí)記憶能力[24]。本課題組前期研究同樣表明，二甲雙胍可改善糖尿病大鼠顱內(nèi)AD樣的病理改變[5]。在本研究中，在糖尿病前期之后以及卒中發(fā)生前使用二甲雙胍，模擬了臨床常見的患者狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能改善糖尿病前期合并缺血性卒中后認(rèn)知功能障礙。糖-能量代謝狀態(tài)和Aβ蛋白，tau蛋白以及神經(jīng)再生有關(guān)[25]，本研究檢測了相關(guān)生化指標(biāo)，發(fā)宮實(shí)驗(yàn)觀察到的空間學(xué)習(xí)記憶能力差異并不是由運(yùn)動(dòng)功能受損導(dǎo)致的。

表4 Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所在各象限逗留時(shí)間占總時(shí)間比例

表5 二甲雙胍治療對Morris水迷宮的影響

改善卒中后認(rèn)知功能障礙的治療手段非常有限。近來的研究結(jié)果表明早期預(yù)防糖尿病可以降低認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)[17]。生活方式干預(yù)和二甲雙胍治療被推薦用于糖尿病前期患者以預(yù)防糖尿病的發(fā)生[18]。與生活方式干預(yù)相比，二甲雙胍成本更低，并且不受患者活動(dòng)能力的影響[19]。然而，二甲雙胍對認(rèn)知功能的作用，目前仍存在爭議。有臨床研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可導(dǎo)致認(rèn)知功能障現(xiàn)二甲雙胍可降低空腹血糖。另一方面，臨床研究表明二甲雙胍可改善卒中結(jié)局[26-27]，而基礎(chǔ)研究表明二甲雙胍可減小梗死體積[28-30]。因此，本研究所觀察到的二甲雙胍對認(rèn)知功能的影響可能與降低血糖、保護(hù)腦組織有關(guān)，這還需要后續(xù)的研究加以證實(shí)。

表6 二甲雙胍治療對Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所在各象限逗留時(shí)間占總時(shí)間比例的影響

表7 二甲雙胍對生化指標(biāo)的影響

本研究存在以下局限性：首先，為了減少動(dòng)物的死亡率，本研究采用缺血90 min的MCAO模型，這只能模擬一部分的臨床卒中患者；其次，二甲雙胍對缺血的基底節(jié)區(qū)或者遠(yuǎn)端和記憶有關(guān)的海馬區(qū)的組織病理改變有何影響，本研究并沒有涉及，需要后續(xù)研究進(jìn)一步闡述。

【點(diǎn)睛】約1/3卒中合并糖尿病前期，本研究為改善糖尿病前期合并卒中后長期認(rèn)知功能障礙提供治療依據(jù)。