腦膠質(zhì)瘤中磷脂酰肌醇3—激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶—張力蛋白表達水平

施振華 裘五四 程軍 姜啟周 王衛(wèi)民 秦智勇

[摘要] 目的 探討PI3K、AKT、PTEN在腦膠質(zhì)瘤中的表達。 方法 選擇2017年1～12月在我院及華山醫(yī)院手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者66例的病理標本進行分析，另選擇50例患者的正常腦組織病理標本為參照。應(yīng)用免疫組化方法檢測磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-張力蛋白表達，比較腦膠質(zhì)瘤組織中以及正常腦組織中三者的表達水平，分析腦膠質(zhì)瘤組織中三者陽性表達的相關(guān)性。 結(jié)果 PI3K及AKT在正常腦組織的陽性表達率顯著低于低級別腦膠質(zhì)瘤及高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低級別腦膠質(zhì)瘤顯著低于高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常腦組織PTEN蛋白陽性率100.0%，顯著高于低級別腦膠質(zhì)瘤與高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；低級別腦膠質(zhì)瘤顯著高于高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 PI3K、AKT在腦膠質(zhì)瘤中呈高表達，PTEN呈低表達，且與惡性程度有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）；蛋白激酶B（AKT）；同源磷酸酶-張力蛋白（PTEN）；腦膠質(zhì)瘤

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）14-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of PI3K， AKT and PTEN in gliomas. Methods The pathological specimens of 66 glioma patients who underwent surgery in our hospital and Huashan Hospital from January to December 2017 were analyzed， and another 50 normal pathological specimens were selected as reference group. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of phosphatidylinositol 3-kinase， protein kinase B and homologous phosphatase-tensin. The expression of three indicators between glioma tissues and normal brain tissues was compared to analyze the correlation between the three positive expressions in glioma tissues. Results The positive expression rates of PI3K and AKT in normal brain tissue were significantly lower than those in low-grade gliomas and high-grade gliomas， and the difference was significant（P<0.05）. And the positive expression rates of PI3K and AKT in the low-grade gliomas were significantly lower than those in high-grade gliomas， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive rate of PTEN protein in normal brain tissue was 100.0%， which was significantly higher than that in low-grade glioma and high-grade glioma， with significant difference（P<0.05）. And the positive rate of PTEN protein in the low malignant glioma was significantly higher than that in high grade glioma， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion PI3K and AKT are highly expressed and PTEN is low-expressed in gliomas， which is related to the degree of malignancy.

[Key words] Phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）； Protein kinase B（AKT）； Homologous phosphatase-tensin（PTEN）； Glioma

膠質(zhì)細胞是分布在中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的支持細胞，包括星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和無突膠質(zhì)細胞。腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%，年發(fā)病率大約5/100 000，每年新發(fā)病例超過14 000例，65歲以上人群中發(fā)病率明顯增高。臨床上有三高一低，發(fā)病率高，復(fù)發(fā)率高，死亡率高，治愈率低。腦膠質(zhì)瘤的臨床癥狀根據(jù)發(fā)病部位不同而不同，臨床診斷主要依賴影像學(xué)，磁共振波譜成像可用于膠質(zhì)瘤與膿腫、炎癥及其他非腫瘤性疾病的鑒別診斷。腦膠質(zhì)瘤的治療采用以手術(shù)切除為主，結(jié)合放療、化療等綜合療法。PI3K-Akt是一條經(jīng)典的信號途徑，蛋白激酶B（AKT）在細胞存活和凋亡中起重要作用[1，2]。同源磷酸酶-張力蛋白（PTEN）基因是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，PTEN蛋白能夠通過去磷酸化參與細胞調(diào)控，許多癌基因的產(chǎn)物都是通過磷酸化而刺激細胞生長[3，4]。本研究分析腦膠質(zhì)瘤中PI3K、AKT、PTEN的表達，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2017年1～12月在我院及復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者66例的病理標本進行分析。66例患者中，男37例，女29例，年齡18～69歲，平均（44.8±16.1）歲；低級別32例，高級別34例。另選擇50例患者的正常腦組織病理標本為參照，其中男27例，女23例，年齡20～60歲，平均（43.6±15.5）歲。

1.2實驗指標及方法

1.2.1 儀器 恒溫箱、高壓鍋、石蠟包埋機、石蠟切片機、顯微鏡。

1.2.2試劑 兔抗人多克隆抗體PI3K，兔抗人多克隆抗體AKT，鼠抗人單克隆抗體PTEN，DAB顯色劑。

1.2.3檢測方法 采用免疫組化方法，連續(xù)切片，烤箱中60℃，6 h；脫蠟，梯度酒精脫水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加兔抗人多克隆抗體PI3K（或兔抗人多克隆抗體AKT，或鼠抗人單克隆抗體PTEN），孵育30 min，滴加二抗，孵育30 min，滴加DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片；PBS替代一抗為陰性對照。

1.3結(jié)果判斷[5]

均表達在胞漿。陽性率計分：0分為陽性率為0，1分為陽性率1%～10%，2分為11%～50%，3分為51%～80%，4分為>80%；顯色程度計分：0分為無顯色，1分為淺棕黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。兩者乘積判斷陰性或陽性：乘積為0為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，>4分為強陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，相關(guān)性分析采用Spearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K在正常腦組織及低級別腦膠質(zhì)瘤、高級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

見表1。PI3K在正常腦組織的陽性表達率顯著低于低級別腦膠質(zhì)瘤及高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.707，5.823，P<0.05）；低級別腦膠質(zhì)瘤顯著低于高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.059，P<0.05）。

2.2 AKT在正常腦組織及低級別腦膠質(zhì)瘤、高級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

見表2。AKT在正常腦組織的陽性表達率顯著低于低級別腦膠質(zhì)瘤、高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.468，37.129，P<0.05）；低級別腦膠質(zhì)瘤顯著低于高級別腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.131，P<0.05）。

2.3 PTEN蛋白在正常腦組織及低級別腦膠質(zhì)瘤、高級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

見表3。正常腦組織PTEN蛋白陽性率100.0%，顯著高于低惡性腦膠質(zhì)瘤與高惡性腦膠質(zhì)瘤，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.139、46.577，P<0.05）；低惡性腦膠質(zhì)瘤顯著高于高惡性腦膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.855，P<0.05）。

2.4腦膠質(zhì)瘤組織中三者表達相關(guān)性分析

見表4。PI3K與AKT呈顯著正相關(guān)的關(guān)系（r=0.389）；PI3K與PTEN呈顯著負相關(guān)的關(guān)系（r=-0.559）；PI3K與PTEN呈顯著負相關(guān)的關(guān)系（r=-0.571）。

3討論

PI3K家族調(diào)控細胞的生長及代謝，活性升高與癌癥有關(guān)。磷脂酰肌醇PI在細胞膜組分中占比例小，但在腦細胞膜中的含量豐富[5，6]。PI3K磷酸化PI，形成的產(chǎn)物影響細胞的功能。單磷酸化能刺激細胞遷移，二磷酸可促進細胞的增殖以及對抗凋亡[7，8]。三磷酸化能夠調(diào)節(jié)細胞粘附、生長及存活[9，10]。PI3K-Akt是經(jīng)典的信號通路，AKT活化后可磷酸化多種激酶以及轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞功能的作用[11]。AKT激活底物，促進肌細胞對葡萄糖的吸收增加。GSK3β被AKT磷酸化后活性被抑制，導(dǎo)致葡萄糖代謝增加，調(diào)節(jié)細胞周期。AKT磷酸化TSC1/2能夠阻止后者對小G蛋白Rheb的負調(diào)控，使Rheb富集，活化mTOR復(fù)合體，蛋白翻譯被激活，促使細胞生長。AKT還有抗凋亡的作用。IkB激酶可以被ATK激活，導(dǎo)致IκB的降解，后者能夠抑制NF-κB，被降解后導(dǎo)致NF-κB釋放，靶基因激活，細胞凋亡被抑制。BADBcl-2家族成員，被AKT磷酸化后，阻止其結(jié)合Bcl-XL誘發(fā)的凋亡。AKT還能夠抑制caspase-9的活性，抑制凋亡級聯(lián)反應(yīng)的激活[12]。p53是一種腫瘤抑制因子，調(diào)控DNA修復(fù)、凋亡、細胞周期。p53結(jié)合蛋白MDM2可被Ak磷酸化， p53活性受到影響，p53蛋白降解增加，影響細胞存活。PI上有5個位點可以被磷酸化，第4位與第5位可以被多種激酶磷酸化，尤其在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，多磷酸化這兩個位點進行修飾。磷酸酶C作用于PIP2，生成DAG與肌醇三磷酸。PI3K將一個磷酸基團轉(zhuǎn)移至第3位點，形成單磷酸肌醇，能夠刺激細胞的遷移，而未發(fā)生磷酸化的肌醇三磷酸沒有這種作用。肌醇二磷酸能夠促進細胞增殖，對抗細胞凋亡，肌醇三磷酸調(diào)節(jié)細胞生長、粘附及存活。三類PI3K結(jié)構(gòu)以及功能不同。針對Ⅰ類的研究較多，是異源二聚體，調(diào)節(jié)亞基的結(jié)構(gòu)域可結(jié)合相應(yīng)的靶點蛋白，催化亞基共有4種，在各種細胞中廣泛分布，δ僅出現(xiàn)在白細胞內(nèi)。生長因子、信號傳導(dǎo)物等可激活PI3K，這些因子激活RTK，導(dǎo)致自磷酸化。多種蛋白含有PH結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合PI-3，4-P2等，可控制蛋白與膜結(jié)合的位置、時間，調(diào)節(jié)蛋白活性，這種相互作用還會改變蛋白構(gòu)想從而改變蛋白的功能。PI3K被激活后，在質(zhì)膜上產(chǎn)生PIP3第二信使，與細胞內(nèi)信號蛋白上的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使AKT蛋白磷酸化而被活化，其他底物還有蛋白激酶C等。AKT是PI3K的主要下游效應(yīng)物。AKT活化后，可視多種酶、激酶、轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)生磷酸化，調(diào)節(jié)細胞功能。AKT能夠促進葡萄糖代謝，其激活底物AS160，促進肌細胞吸收葡萄糖。AKT可通過磷酸化GSK3β來抑制其活性，促進葡萄糖代謝，調(diào)節(jié)細胞周期。AKT是TSC1/2磷酸化阻滯其對Rheb的負調(diào)控作用，使后者聚集，激活蛋白翻譯，促進細胞生長。AKT通過磷酸化下游靶蛋白發(fā)揮抗凋亡的作用。AKT通過IκB激酶的磷酸化，導(dǎo)致IκB降解，而IκB是NF-κB抑制劑，進而導(dǎo)致后者大量蓄積、釋放、核轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡，促進細胞存活。

PTEN是一個關(guān)鍵磷酸酶，在多種腫瘤中發(fā)生基因突變或基因缺失。PTEN作為PIP3-磷酸酶，與PI3K功能相反，通過去磷酸化PIP3生成PI-4、5-P2[13，14]。PTEN減少AKT活化，阻止由AKT調(diào)控的下游事件。PTEN通過產(chǎn)生PIP2發(fā)揮的功能不僅是對抗AKT的作用。PIP2是磷脂酶Cβ的底物，第二信使為DAG和IP3，能夠?qū)е录毎麅?nèi)鈣離子水平升高，激活蛋白激酶C。PIP2與膜結(jié)合，能增加多種離子通道活性。PIP也參與到膜泡的形成以及細胞骨架與膜的相互作用過程中。且PIP2能影響多種脂代謝相關(guān)酶的活性。

本研究中，腦膠質(zhì)瘤組織中PI3K與AKT呈高表達，且高級別腦膠質(zhì)瘤中的陽性表達率超過90.0%，顯著高于低級別腦膠質(zhì)瘤組織；腦膠質(zhì)瘤組織中PETN呈低表達，在正常腦組織中陽性率為100.0%，而在腦膠質(zhì)瘤組織中呈低表達，尤其在高級別腦膠質(zhì)瘤組織中，陽性表達率更低。與既往的研究結(jié)果相似[15]。此結(jié)果提示PI3K與AKT可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生，且與惡性程度有關(guān)，其可以成為潛在的治療靶點。PTEN蛋白的表達缺失或下降導(dǎo)致抑癌能力下降，與腫瘤的發(fā)生也有關(guān)系[16-20]。

綜上所述，PI3K與AKT在腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，其可能成為潛在的治療靶點；PI3K與AKT、PENT呈負相關(guān)的關(guān)系，提示PENT可能拮抗PI3K與AKT的作用。

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（收稿日期：2018-01-22）