UPLC-MS/MS檢測(cè)血液中的東莨菪堿和右美托咪定

王瑞花，欒玉靜，董 穎，杜鴻雁，王愛華

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

東莨菪堿（Scopolamine）是一種莨菪烷型生物堿[1]，存在于茄科植物中，可用于麻醉鎮(zhèn)痛、止咳、平喘，對(duì)動(dòng)暈癥有效，具有鎮(zhèn)靜、致幻作用[2-3]。右美托咪定作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑[4-5]，擁有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感及呼吸抑制輕等特點(diǎn)[6]，鎮(zhèn)靜效應(yīng)呈自然睡眠樣[7]，是一種隨時(shí)可喚醒的鎮(zhèn)靜劑[8]，廣泛用于臨床麻醉。近年來(lái)用二者混合物實(shí)施麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸、殺人的案件不斷增多。究其原因，筆者認(rèn)為右美托咪定可使人失去意識(shí)，中樞性差，東莨菪堿可以起到中樞鎮(zhèn)靜作用，二者合用具有很好的協(xié)同作用，更主要的是二者不被管制，容易獲得，且無(wú)色無(wú)味，放在飲料里很難被察覺?，F(xiàn)有的檢驗(yàn)方法僅限于單一藥物的檢驗(yàn)，主要有高效液相色譜方法[9-11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]、毛細(xì)管電泳法[17]等。因而，本文旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)全血中東莨菪堿和右美托咪定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，以滿足刑事案件的檢驗(yàn)需求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLCXevo TQ MS系統(tǒng)， Masslynx工作站( 美國(guó)Waters 公司) ，Milli-Q 純水系統(tǒng)( 美國(guó)Millipore 公司 )， BP210s 電子天平 (德國(guó) Sartorius公司) ，東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，純度大于99.0%），右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)DrEhrebstorfer，99.0%），乙腈、甲酸銨為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取右美托咪定、東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別定容于10 mL的甲醇中，配置成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在4 ℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)需要，用乙腈逐級(jí)稀釋。

1.3 樣品的制備

取血液樣品1.0 mL，用4 mL 0.1 moL/L的鹽酸進(jìn)行稀釋，振蕩、離心（8000 r/min，20 min），上清液經(jīng)3 mL甲醇活化，3 mL水、0.1 moL/L的鹽酸潤(rùn)洗過的Oasis MCX固相萃取柱，經(jīng)3 mL 0.1 moL/L的鹽酸、3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，離心甩干萃取柱，3 mL 2%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃空氣流下?lián)]干，500 μL初始流動(dòng)相定容，過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，供LC-MS/MS分析。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱( 100 mm×2. 1 mm，1.7 μm) ，柱溫35 ℃。流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B： pH 9水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，詳見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradient of mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源( ESI) ，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式( MRM)，毛細(xì)管電壓1.0 kV，去溶劑溫度450 ℃，去溶劑氣流速1000 L/h。兩種物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 東莨菪堿和右美托咪定的檢測(cè)參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and dexmedetomidine

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

根據(jù)東莨菪堿和右美托咪定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇電噴霧正離子電離模式，取200 ng/mL東莨菪堿、右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)溶液，以20 μL/min的速度直接進(jìn)樣，分別對(duì)噴霧電壓、毛細(xì)管溫度、霧化流速及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過全掃描方式觀察，得到目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子。通過碰撞反應(yīng)進(jìn)行離子掃描，選擇豐度較大的兩個(gè)子離子作為定量離子和輔助定性離子，目標(biāo)物的質(zhì)譜條件見表2。

實(shí)驗(yàn)考察了在ACQUITY UPLC?HSS T3 、ACQUITY UPLC BEH C18兩種不同柱子和酸性（pH=3）堿性（pH=9）條件下不同流動(dòng)相對(duì)二者的分離效果。結(jié)果表明此兩款柱子均可達(dá)到對(duì)二者的分離，但在酸性條件下，東菪莨堿因溶劑效應(yīng)的影響，存在前拖尾現(xiàn)象，在ACQUITY UPLC BEH C18柱上堿性條件下分離，其效果好，靈敏度高、峰形對(duì)稱，分析結(jié)果見圖 1～3。

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，分析空白血樣，不受血液中基質(zhì)的干擾（見圖4），東莨菪堿和右美托咪定具有良好的色譜峰，保留時(shí)間分別為1.46 min 和1.89 min（見圖5）。表明本方法具有良好的專屬性。

圖1 BEH C18柱總離子流圖 ( pH=3)Fig.1 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=3)

圖2 HSS T3柱總離子流圖( pH=3)Fig.2 TIC chromatogram of HSS T3 (pH=3)

圖3 BEH C18柱總離子流圖(pH=9)Fig.3 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=9)

圖4 空白血MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of blank blood

圖5 空白血添加50ng標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of 50ng standard substance in blank blood

2.2 前處理方法的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了液液萃取、乙腈沉淀蛋白和固相萃取3種方法對(duì)兩種化合物的提取效果，表明東莨菪堿液液萃取提取回收率低，乙腈沉淀蛋白法簡(jiǎn)單快速，但二者之間的回收率差異較大。針對(duì)固相萃取實(shí)驗(yàn)比較了Oasisò HLB與OasisòMCX兩種小柱，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3，本實(shí)驗(yàn)最終選用萃取物干凈、萃取效果好的OasisòMCX柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 乙腈沉淀蛋白、液液提取和固相萃取的平均回收率Table 3 Average recovery rate of acetonitrile-precipitated protein, liquid-liquid extraction and solid phase extraction

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

毒物分析中最常用的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法是提取后加入法。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜峰面積(S1) 和空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積(S2) ，以比值S2 /S1(%)來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)四種提取方法的基質(zhì)效應(yīng)做了比較，結(jié)果顯示OasisòMCX萃取的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，血液中兩種藥物在10、50、100 ng /L 濃度時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)值均在87.1%～107.6%之間。

2.4 線性范圍和檢出限

血樣1.0 mL若干份，分別加入適量的東莨菪堿和右美托咪定標(biāo)準(zhǔn)工作液，使二者在血液樣品中的濃度分別為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL，按照1.3的方法進(jìn)行提取，1.4的方法進(jìn)行分析，以濃度對(duì)定量離子的峰面積進(jìn)行線性回歸，得右美托咪定和東莨菪堿的回歸方程分別為：y= 710.33x+1652.4和y= 444.16x- 1087；二者均在1.0～200.0 ng/mL 線性范圍內(nèi)關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.9991和R2=0.9962。按信噪比（S/N）≥3，計(jì)算得血液中二者的檢出限均低于0.1 ng/mL。

2.5 回收率和精密度

取空白血液1.0 mL，配制東莨菪堿和右美托咪定高、中、低3個(gè)濃度（10、50、200 ng/mL）的血液樣，每一濃度平行5份，按照1.3和1.4項(xiàng)下的方法操作，每個(gè)濃度同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定3次，根據(jù)目標(biāo)物特征離子峰面積計(jì)算回收率及日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表4。

表4 血液樣本中東莨菪堿和右美托咪定的回收率及精密度（n=5）Table 4 Precision and recovery of scopolamine and dexmedetomidine in blood samples (n=5)

2.6 案例應(yīng)用

2016年8月8日，某市110指揮中心接警稱，某停車場(chǎng)一輛車內(nèi)發(fā)現(xiàn)一具男性尸體。送檢檢材為胃內(nèi)容及血，經(jīng)篩查，胃內(nèi)容中含有東莨菪堿和右美托咪定，采用本文方法，從血及胃內(nèi)容中均檢出右美托咪定和東莨菪堿，血中右美托咪定和東莨菪堿的含量分別為49.4 ng/mL和142.0 ng/mL。

3 結(jié)論

本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)東莨菪堿和右美托咪定，方法前處理簡(jiǎn)單，使用有機(jī)溶劑少，降低了雜質(zhì)干擾，回收率高，靈敏度高，重現(xiàn)性好，定性、定量準(zhǔn)確。該方法有效提高了所涉及案件中東莨菪堿和右美托咪定檢測(cè)的專一性和靈敏度，為公安部門偵破此類案件提供了重要的技術(shù)支持。