英國史賓格犬感染H3N2亞型犬流感病毒后的病理損傷

秦海斌 賀星亮 宋珍華 溫 海 朱 騫

流感是流行性感冒（Influenza）的簡稱，是由流感病毒引起的以呼吸系統(tǒng)癥狀為主的急性傳染病，犬流感作為一種新型流感類型是由犬流感病毒（Canine infl uenza virus，CIV）引起的以精神沉郁、體溫升高、咳嗽、流鼻涕、呼吸困難為主要臨床特征的疾病。流感病毒根據(jù)其核蛋白（Nucleoprotein，NP）和膜蛋白（Matrix proteins，M1）的特性不同，可分為甲、乙、丙三型，甲型流感依據(jù)HA和NA抗原的血清學特征分為135種HN亞型。

流感病毒的重要流行病學特征是種間傳播，目前報道的馬源犬 H3N8、禽源H5N1 亞型CIV、禽源 H3N2流感病毒均可跨越種間傳播，但鑒于H3N8、H3N2亞型已經在犬群中水平傳播并形成了穩(wěn)定的譜系，因此狹義上的犬流感病毒特指這兩個亞型，其中H3N8主要在北美洲流行，H3N2主要在東南亞、韓國及中國流行，國內對犬流感病毒的研究多以H3N2亞型為主導。有研究證實，在世界范圍內已經有多個其他亞型的甲型流感病毒在犬之間實現(xiàn)了自然傳播，包括禽源H5N2、H9N2、H3N2重組的H3N1亞型、季節(jié)性H3N2人流感和2009年甲型人流感亞型等。犬已經成為流感病毒的易感動物。

犬流感癥狀與支氣管博氏桿菌或犬副流感病毒引起的窩咳相似，不同的是，嚴重犬流感可引起高燒，溫度可達39.5℃～41.5℃，個別出現(xiàn)肺炎，嚴重時會引起死亡。該病在警犬技術實踐中發(fā)現(xiàn)，犬流感發(fā)病率高，但癥狀輕微，潛伏期為2～5天，咳嗽一般持續(xù) 3 周左右，初期表現(xiàn)為柔性濕咳，個別也可能出現(xiàn)干性咳嗽，運動和應激可引發(fā)劇烈咳嗽，該病死亡率不高，死亡犬多死于自身免疫功能低下導致的繼發(fā)肺部感染。

但有一個重要的不可忽視的問題是：嗅覺是警犬嗅探作業(yè)的基礎，是影響警犬實戰(zhàn)能力的關鍵因素，犬流感病毒對工作犬上呼吸道的感染伴隨著嗅覺通路的損傷。在人的相關研究中，上呼吸道感染后的嗅覺損傷以器質性損傷為主，少數(shù)伴有神經系統(tǒng)的損傷，是嗅覺功能障礙的首要的因素，由其導致的嗅覺障礙占嗅覺障礙人群的18%～36%，嗅覺損傷部分表現(xiàn)為炎癥反應，鼻黏膜腫脹，分泌物增多，到達嗅區(qū)的空氣減少，導致嗅覺減退；另一部分表現(xiàn)為嗅上皮反復損傷，嗅黏膜遭到嚴重破壞，逐漸被呼吸上皮取代或發(fā)生鱗狀上皮化生，嗅覺感受細胞發(fā)生不可逆改變，從而喪失嗅覺功能。嗅覺功能障礙患者中有40%的嗅覺不能恢復。目前警犬嗅覺損傷尚缺乏相關的研究數(shù)據(jù)，但結合近年來不斷上升的上呼吸道感染疾病，推測嗅覺功能減退和嗅覺功能喪失在警犬中占有一定比例。

對此筆者在2016～2018年的中國警犬犬流感流行病學調查的研究中，對主要流行于東南亞及我國的H3N2亞型犬流感病毒進行了血清學調查，發(fā)現(xiàn)我國警犬的總體感染率約為6%。為了進一步驗證上呼吸道感染后警犬的病理變化，尤其是嗅覺通路相關組織器官的損傷，筆者以英國史賓格犬作為實驗用動物，建立了H3N2亞型流感病毒人工感染模型，對感染模型的病理變化及嗅覺通路的損傷進行了研究，發(fā)現(xiàn)感染后史賓格犬的上呼吸道、消化道等多個系統(tǒng)的組織器官出現(xiàn)了炎癥變化，在我們重點關注的嗅覺通路相關組織器官中嗅覺黏膜上皮出現(xiàn)了炎癥變化，嗅覺神經器官未見病理損傷，提示嗅覺功能的損傷主要發(fā)生在上呼吸道黏膜上皮中。

一、研究方法

CIV地方毒株A/canine/Nanjing/11/2012(H3N2)毒株經雞胚傳代后，取1mL HA效價為28的病毒經鼻腔、口咽部感染健康史賓格犬，麻醉后采集體內各個組織器官，包括鼻甲、喉頭、氣管、支氣管、細支氣管、肺臟等呼吸系統(tǒng)組織；食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、盲腸、直腸消化系統(tǒng)組織；心、肝、脾、腎、胰臟、胸腺、扁桃體、腸系膜淋巴結、大腦、小腦、嗅球、睪丸、骨骼肌等其他組織器官。器官采集后以10%的多聚甲醛固定，4℃保存?zhèn)溆?。按照常?guī)方法操作石蠟包埋、組織切片、脫蠟水化、抗原修復，切片厚度為4～7um，然后進行HE染色：切片脫蠟水化后，蘇木素染液染色5～20min（根據(jù)不同組織和實驗要求調整），自來水沖洗，分化液分化30s，自來水浸泡15min或溫水（約50度）5min，置伊紅染液2min（根據(jù)不同組織和實驗要求調整），自來水沖洗，自來水浸泡5min，梯度酒精脫水： 95%、100%I、100%II各1min，二甲苯透明：二甲苯I、II各10min，中性樹膠封片，放入60度烘箱中烤干，顯微鏡下觀察。

二、研究結果

人工感染H3N2亞型犬流感病毒后，史賓格犬不同組織器官的HE染色圖片，見下圖：

對圖中不同器官的病理學變化進行概略描述，見下表。

輕微炎癥，輕微炎性細胞浸潤會咽軟骨 未見異常咽未見異常食道 未見異常胰腺 未見異常肝輕微炎癥，輕微炎性細胞浸潤胃輕微炎癥十二指腸 輕微炎癥，輕微炎性細胞浸潤空腸 輕微炎癥回腸 輕微炎癥結腸 輕微炎癥盲腸 輕微炎癥扁桃體 輕微細胞增生，淋巴濾泡增多，輕微炎癥胸腺 未見異常脾 脾竇擴張充血，淋巴細胞增多，中度炎癥腸淋巴結 淋巴細胞增多，中度炎癥心肌 未見異常樣本 H E分析鼻甲 鼻粘膜可見炎癥侵潤鼻中膈 中度炎癥大腦 未見異常小腦 未見異常嗅球 未見異常氣管 未見異常支氣管 未見異常細支氣管 未見異常肺腎腎小球體積增大且細胞增多，部分腎小管上皮細胞壞死脫落和水腫，輕微炎性細胞浸潤睪丸 未見異常骨骼肌 未見異常

三、討論

根據(jù)圖和表的結果，不難發(fā)現(xiàn)在犬流感病毒感染模型中，流感病毒對上呼吸道、消化器官、免疫器官、泌尿生殖器官造成了較大的損傷；在上呼吸道的鼻甲、鼻中膈的黏膜上皮中可見明顯的炎性浸潤，這與感染模型表現(xiàn)出的流鼻涕、咳嗽等癥狀相吻合，從嗅覺通路的組成來看，鼻甲骨和鼻中膈的黏膜是重要的嗅細胞分布區(qū)域，因此流感病毒的感染對嗅覺通路中嗅細胞的損傷是不可避免的；在嗅覺相關神經組織中，主要包括大腦、小腦。嗅球未見明顯的病理學變化，說明病毒對神經器官無病理性損傷。在感染模型中，流感樣的癥狀可持續(xù)至病毒感染后2周， 說明對嗅覺黏膜的損傷可持續(xù)至感染后2周，但嗅覺上皮的功能恢復、是否發(fā)生嗅覺功能障礙等問題，由于目前缺乏有效的嗅覺能力測定手段而無法開展。在今后的研究中，客觀、精確的嗅覺能力評價方法是警犬技術領域需要重點研究的方向，這不僅是阻礙工作犬嗅覺相關基礎研究的難點問題，也是涉及到嗅覺障礙、遺傳育種、日常訓練、警犬實戰(zhàn)的多個方面的重點問題。

另外，流感病毒的高頻率抗原變異，必需引起重視。流感病毒的血凝素（HA）識別的受體分為2類：α-2,3半乳糖苷唾液酸（SA2，3Gal）和α-2,6半乳糖苷（SA2，6Gal）。禽流感病毒和馬流感病毒對SA2，3Gal具有親嗜性，而人流感病毒和豬流感病毒對SA2，6Gal的親和性最高，由于豬呼吸道上皮細胞同時具有2種類型的流感病毒受體，因此，人流感病毒和禽流感病毒都可以感染豬，豬被認為是禽流感病毒、人流感病毒的基因重配的中間宿主和基因“混合器”。對犬的研究發(fā)現(xiàn)，犬的呼吸道上皮細胞也同時表達2種唾液酸受體，加上多種亞型（馬源H3N8、禽源H3N2、H5N1、H5N2、H9N2）的流感病毒對犬易感，在理論上犬已經具備了通過基因重組產生新型流感病毒的基本條件，在現(xiàn)實中犬是否會跟豬一樣最終成為另一個新的流感病毒基因“混合器”，值得公共衛(wèi)生領域和警犬技術領域長期關注。