小麥籽粒清蛋白和球蛋白條件和非條件QTL分析

周 夢，趙 勇，李珊珊，徐 渴，張樹華，楊學舉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河北保定 071001； 2.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071001)

小麥(TriticumaestivumL.)籽粒中蛋白組分含量直接反應小麥品質(zhì)，決定小麥最終用途。根據(jù)蛋白溶解特性，Osborne等[1]將蛋白質(zhì)分為溶于水的清蛋白(albumin)和溶于稀鹽的球蛋白(globulin)等，分子量約為l.2～20 kDa。與小麥其他籽粒蛋白相比，清蛋白和球蛋白由于富含賴氨酸和蛋氨酸，而被認為是高營養(yǎng)價值的蛋白組分[2]。α-淀粉酶/胰蛋白酶、絲氨酸、蛋白酶抑制劑和嘌呤霉素的主要成分為清蛋白和球蛋白，它們是胚胎萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)，并能保護其免受昆蟲和病原體的侵害[3]。但小麥籽粒蛋白質(zhì)組分含量的遺傳基礎復雜，是受多基因控制的數(shù)量性狀[4]，且清蛋白和球蛋白的含量在整個灌漿期不斷變化，故難以用傳統(tǒng)的遺傳學來研究基因效應。

過去應用QTL研究小麥蛋白質(zhì)組分通常是在收獲后測定表型值，只有終端表達情況。吳為人等[5]提出了動態(tài)QTL，揭示不同發(fā)育階段與蛋白合成有關的QTL動態(tài)表達，并與非條件QTL結合分析，提高了QTL定位的靈敏度和準確度。動態(tài)條件QTL定位分析已經(jīng)在小麥中得到廣泛應用，如：Zhang等[6]對小麥葉片中葉綠素含量進行了發(fā)育動態(tài)的QTL分析，劉 賓等[7]對小麥株高進行了發(fā)育動態(tài)的非條件QTL和條件QTL分析，Wu等[8]、Wang等[9]也分別對小麥株高進行了發(fā)育動態(tài)的QTL分析。

在小麥中，對蛋白質(zhì)組分含量QTL定位的研究也有一些報道，石培春等[10]以RIL群體為材料，對小麥籽粒蛋白質(zhì)組分含量進行了非條件QTL分析，分別檢測出與清蛋白含量和球蛋白含量有關的位點各1個。孫海艷等[11]利用“川35050×山農(nóng)483”構建的含131個家系的RIL群體，對小麥蛋白和淀粉相關品質(zhì)性狀進行了QTL分析，發(fā)現(xiàn)3個與蛋白含量相關的QTL，分別位于3B、5A和6A染色體。Zhang等[12]以PH82-2和內(nèi)鄉(xiāng)188為親本獲得的含有240個家系的RIL群體為材料，檢測到8個與谷蛋白含量相關的QTL，分布于1A、1B、1D、3A、4A和5D染色體。Li等[13]以兩個分別含有485和229個家系的RIL群體為材料，共檢測出21個與蛋白含量相關的位點，其中在5A染色體上檢測到一個控制蛋白含量的主效位點，貢獻率為53.04%。

然而，到目前為止，尚未利用條件QTL和非條件QTL分析方法對小麥籽粒灌漿期清蛋白和球蛋白含量進行動態(tài)QTL分析。本研究以小麥DH群體為材料，在2年3點6個環(huán)境下測定灌漿期5個階段小麥籽粒中兩種蛋白含量，利用相關作圖方法分析兩種蛋白含量的發(fā)育動態(tài)的條件和非條件QTL，以期為剖析小麥蛋白質(zhì)組分動態(tài)積累遺傳基礎，同時為進一步開發(fā)主效基因的分子標記、改善小麥品質(zhì)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以小麥品種花培3號與豫麥57雜交，經(jīng)花粉培養(yǎng)和染色體加倍獲得168個DH系，本研究即以這些DH系為材料。花培3號和豫麥57分別于2006年和2004年通過河南省和國家農(nóng)作物品種審定委員會審定，二者在品質(zhì)性狀上存在較大差異[14-15]。

1.2 試驗設計

1.2.1 田間種植

2011年10月，將DH群體及親本分別種植于河北省保定市農(nóng)科所育種試驗地(38.85°N,115.5°E,環(huán)境E1))、邢臺市農(nóng)科院育種試驗地(37.13°N,114.68°E,環(huán)境E2)和滄州市青縣原種場(38.58°N,116.82°E,環(huán)境E3)。采用隨機區(qū)組設計，設置3次重復，3行區(qū)，行長3 m，行距25 cm，株距10 cm。2012年10月，在上述3地點重復種植DH群體，環(huán)境代號分別為E4、E5和E6。

1.2.2 蛋白組分含量的測定

分別在花后12 d(T1)、17 d(T2)、22 d(T3)、27 d(T4)和32 d(T5)取樣，每次取5株麥穗。取穗烘至恒重，手工脫粒，并用粉碎機(Perten hammer mill 3100，瑞典波通)制成全麥粉，過80目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

參考何照范[16]的方法提取蛋白。利用B-324全自動凱氏定氮儀(Buchi公司，瑞士)測定蛋白質(zhì)組分含量，折算成樣本百分率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 13.0軟件進行表型分析及正態(tài)分布檢測。利用ICIMapping 3.3以及QGAstation 2.0軟件分析QTL效應；在ICIMapping3.3軟件中，采用2.5的LOD臨界值，參照Mcintosh等[17]的方法命名QTL，即：“ Q+性狀名稱縮寫+染色體編號 ”。

2 結果與分析

2.1 小麥DH群體及親本清蛋白和球蛋白含量的表型分析

在不同環(huán)境、不同時期，花培3號和豫麥57中清蛋白和球蛋白含量的差異均較大，且存在相同的變化趨勢(表1)。在6個環(huán)境下，T1、T2和T3時期，父本豫麥57中兩種蛋白的含量明顯大于母本花培3號；而T4和T5時期，花培3號則大于豫麥57。且雙親之間兩種蛋白含量的差異均達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，但E1環(huán)境T2時期的清蛋白含量除外。每個時期DH群體各株系兩組分含量差異明顯，存在顯著的超親現(xiàn)象，群體分離連續(xù)性符合正態(tài)分布，適合做進一步的QTL定位分析。

表1 不同環(huán)境條件下小麥親本及DH群體的清蛋白和球蛋白含量Table 1 Albumin and globulin content of DH population and its parents in different environments

/前后的數(shù)值分別代表清蛋白和球蛋白含量；*和**分別表示與豫麥57號在0.05和0.01水平差異顯著。
The values before and after / represent albumin and globulin content,respectively.* and ** represent significant differences at the 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2 清蛋白條件和非條件QTL定位及遺傳效應分析

2.2.1 清蛋白非條件QTL定位

在6個環(huán)境的5個時期共檢測到18個影響清蛋白含量的非條件加性QTL，分別位于1B、2A、2B、3A、6A、6B、7B和7D染色體上(表2)，貢獻率為6.66%～21.67%。貢獻率大于10%的QTL有8個，分別為 QAlu1B、 QAlu1B-1、 QAlu1B-3、 QAlu1B-4、 QAlu6A、 QAlu6A-1、 QAlu7B和 QAlu7B-1，其中6個分布在B染色體組上，2個分布在A染色體組上。貢獻率最大(21.67%)的QTL為 QAlu1B-4。

QAlu1B-3在6個環(huán)境的T4和T5時期均被檢測到，其增效基因來自于母本花培3號。 QAlu7B-1在5個環(huán)境的T2時期和3個環(huán)境的T3時期均被檢測到，其增效基因來自父本豫麥57。 QAlu1B-1在5個環(huán)境的T4時期均被檢測到， QAlu2B和 QAlu6A分別在4個環(huán)境的T5和T1時期被檢測到， QAlu1B在3個環(huán)境的T3時期被檢測到， QAlu2A在2個環(huán)境的T1時期被檢測到，其余QTL只在1個環(huán)境中被檢測到。

2.2.2 清蛋白條件QTL定位

在6個環(huán)境的4個動態(tài)發(fā)育時期共檢測到11個影響清蛋白含量的條件加性QTL，分別位于1B、2B、3A、6A、7B和7D染色體上(表3)，貢獻率為6.44%～16.85%。貢獻率大于10%的QTL有7個，分別為 QAlu1B、 QAlu1B-3、 QAlu2B、 QAlu6A-1、 QAlu7B、 QAlu7B-1和 QAlu7B-2，其中5個分布在B染色體組上，1個分布在A染色體組上。貢獻率最大(16.85%)的QTL為 QAlu1B-4。

QAlu1B-3在6個環(huán)境的T3-T4和T4-T5時期均被檢測到，其增效基因來自母本花培3號(但E6的T3-T4時期除外)。 QAlu1B-1和 QAlu7B-1分別在5個環(huán)境的T3-T4和T1-T2時期均被檢測到， QAlu2B在4個環(huán)境的T4-T5時期均被檢測到， QAlu1B和 QAlu7B-2在3個環(huán)境的T2-T3時期均被檢測到， QAlu6A-1在E2的T1-T2時期和E5的T2-T3時期被檢測到。

2.2.3 清蛋白條件QTL和非條件QTL聯(lián)合分析

從條件和非條件加性QTL綜合分析可以看出，在T2時期， QAlu7B-1、 QAlu6A和 QAlu6A-1在非條件和條件分析中都能檢測到， QAlu7B-1遺傳效應明顯減小，表明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T1-T2)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新的QTL。后兩個位點效應值變化不大，則在該時段(T1-T2)的表達主要為凈遺傳效應，為T2時期檢測到的新基因的表達。在T3時期， QAlu1B和 QAlu7B在非條件和條件分析中都能被檢測到，但 QAlu1B遺傳效應變化明顯，表明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T2-T3)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新的QTL； QAlu6A-1只在條件分析中檢測，說明該QTL全部為凈遺傳效應，但是效應值較小，未在非條件分析中被檢測出。在T4時期， QAlu1B-1和 QAlu1B-3在非條件和條件分析中都能檢測到，但條件QTL遺傳效應明顯變化，說明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T3-T4)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新的QTL。在T5時期，檢測到6個QTL，其中 QAlu1B-3、 QAlu2B和 QAlu3A在非條件和條件分析中都能被檢測到，條件QTL遺傳效應變化明顯，說明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T4-T5)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新基因。 QAlu1B-2、 QAlu1B-4和 QAlu6B只出現(xiàn)在非條件分析中，說明該基因在該時期(T4-T5)沒有表達，無凈遺傳效應。

2.3 球蛋白條件和非條件QTL定位及遺傳效應分析

2.3.1 球蛋白非條件QTL定位

在6個環(huán)境的5個時期共檢測到22個影響球蛋白含量的非條件加性QTL，分別位于1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5A、6A、6B、6D、7B和7D共15條染色體上(表4)，貢獻率為6.72%～25.13%。貢獻率大于10%的QTL共有7個，分別為 QGlo1B、 QGlo1B-2、 QGlo1B-3、 QGlo3A、 QGlo3B-1、 QGlo4B-1和 QGlo6B，其中6個分布在B染色體組上，一個分布在A染色體組上。貢獻率最大(25.13%)的QTL為 QGlo1B-2。

QGlo1B-3在4個環(huán)境的T1和T2時期被檢測到，其增效基因來自父本豫麥57。 QGlo6A、 QGlo2A和 QGlo6B分別在4個環(huán)境的T2、T4和T5時期被檢測到。 QGlo1B-2和 QGlo3B-1均在2個環(huán)境的T3時期被檢測到， QGlo7D-1在2個環(huán)境的T4時期被檢測到，其余QTL只在一個環(huán)境中被檢測到。

表2 小麥籽粒清蛋白含量非條件加性QTL效應Table 2 Additive effects of unconditional QTLs for albumin

表3 各時期小麥籽粒清蛋白含量條件加性QTL效應Table 3 Additive effects of conditional QTLs for albumin at different periods

2.3.2 球蛋白條件QTL定位

在6個環(huán)境的4個動態(tài)發(fā)育時期共檢測到21個影響球蛋白含量的條件加性QTL，分別位于1B、1D、2A、2D、3A、3B、4A、4B、6A、6B、6D和7D共12條染色體上(表5)，貢獻率為6.53%～24.21%。貢獻率大于10%的QTL共有8個，分別為 QGlo1B、 QGlo1B-2、 QGlo1B-3、 QGlo1B-4、 QGlo3B-1、 QGlo4A、 QGlo4B-1和 QGlo6B，其中7個分布在B染色體組上，1個分布在A染色體組上。貢獻率最大(24.21%)的QTL為 QGlo1B-2。

QGlo6B在4個環(huán)境的4個動態(tài)發(fā)育時期均被檢測到，其增效基因來自于父本豫麥57。 QGlo1B-3、 QGlo2A和 QGlo6A分別在4個環(huán)境的T1-T2、T3-T4和T1-T2時期被檢測到， QGlo1B-2、 QGlo3B-1、 QGlo7D和 QGlo7D-1分別在2個環(huán)境的T2-T3、T2-T3和T3-T4時期被檢測到，其余的條件QTL只在1個環(huán)境中被檢測到。

2.3.3 球蛋白條件QTL和非條件QTL聯(lián)合分析

綜合分析各時期檢測到的條件和非條件加性QTL，可以看出，在T2時期，檢測到6個QTL。其中 QGlo1B-3、 QGlo2D、 QGlo6A和 QGlo6D在非條件和條件分析中都能檢測到，但條件QTL遺傳效應發(fā)生變化，說明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T1-T2)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新QTL； QGlo1B和 QGlo6B只出現(xiàn)在條件分析中，說明該QTL全部為凈遺傳效應，但是效應值較小，未在非條件分析中被檢測出。在T3時期，檢測到 QGlo3A-1和 QGlo6B只出現(xiàn)在條件分析中，說明該QTL全部為凈遺傳效應，但是效應值較小，未在非條件分析中被檢測出。其余的QTL在非條件和條件分析中都能檢測到，但條件QTL遺傳效應變化，則該QTL為連續(xù)表達的基因；在該段時間(T2-T3)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新QTL；在T4時期檢測到10個QTL，其中， QGlo2A、 QGlo3A、QGlo4A和 QGlo7D-1在非條件和條件分析中都能被檢測到，但條件QTL遺傳效應變化明顯，說明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T3-T4)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新QTL； QGlo5A和 QGlo7D-2只出現(xiàn)在非條件分析中，說明該基因在該時期(T3-T4)沒有表達，無凈遺傳效應； QGlo6B、 QGlo6D-1和 QGlo7D只出現(xiàn)在條件分析中，說明該QTL全部為凈遺傳效應，但是效應值較小，未在非條件分析中被檢測出。在T5時期檢測到1個QTL，即 QGlo6B該QTL在非條件和條件分析中都能檢測到，但條件QTL遺傳效應變化，說明該QTL為連續(xù)表達的基因，在該段時間(T4-T5)內(nèi)既有凈遺傳效應，也有累加效應，但不是新QTL。

表4 各時期小麥籽粒球蛋白含量非條件加性QTL效應Table 4 Additive effects of unconditional QTLs for globulin at different periods

表5 各時期小麥籽粒球蛋白含量的條件加性QTL效應Table 5 Additive effects of conditional QTLs for globulin at different periods

3 討 論

非條件QTL分析是根據(jù)作物生長發(fā)育終端的表型數(shù)據(jù)進行QTL分析，最終體現(xiàn)的是基因的累加效應，而條件QTL則根據(jù)作物生長過程中不同階段，或在給定某種條件下，對性狀的凈增加值進行基因定位；可針對同一性狀，在不同生長階段，檢測表達的QTL或同一位點在各種環(huán)境下表達的QTL，解釋基因表達的凈遺傳效應[18]。本研究將條件QTL和非條件QTL結合使用，可以檢測到在特定時期和時間段內(nèi)表達的QTL，能更綜合、更全面地掌握控制性狀的基因的表達動態(tài)。

研究結果表明，兩者定位結果不完全一致，控制清蛋白和球蛋白積累的基因的表達具有明顯的時空性。在5個取樣時期，檢測到影響清蛋白和球蛋白含量的非條件QTL共有40個，條件QTL共有32個。未檢測出在整個灌漿期都表達的位點，說明控制小麥籽粒蛋白質(zhì)組分含量的基因有選擇性表達，這與發(fā)育遺傳學理論是一致的[19]。但 QAlu-1B-3、QAlu-7B-1、QAlu-6A-1和 QGlo-1B-3在整個灌漿過程中的多個階段被檢測出，并在不同中環(huán)境得到表達，為持續(xù)表達基因。條件加性QTL的定位結果顯示，條件加性QTL位點 QGlo6B在灌漿的后4個時期連續(xù)出現(xiàn)，但 QGlo6B只在最后1個時期才被檢測到非條件加性QTL，說明在發(fā)育開始的前3個時期， QGlo6B的表達全部為凈遺傳效應，而 QGlo6B在最后1個時期的非條件QTL分析中出現(xiàn)，說明其微效效應值積累到一定程度就可以被檢測出。由此可見，條件QTL可以檢測出被非條件QTL忽視的微效基因，通過兩種方法結合，可以獲得更加準確和完整的結果，以幫助揭示表達基因數(shù)量及其各種發(fā)育功能。

朱占玲等[20]對小麥籽粒蛋白質(zhì)含量進行了發(fā)育動態(tài)QTL分析，檢測到一些相同區(qū)域，例如Xwmc222-Xgdm60、Xgwm295-Xgwm676、Xgdm60-Xwmc429和Xgdm67-Xwmc634等，其中 QGpc1D位于標記區(qū)間Xgdm60-Xwmc429，在籽粒灌漿的三個時期檢測到，本研究中檢測到控制球蛋白含量的 QGlo1D同樣標記在此位點，可能是一因多效。Zhao等[21]檢測到1個與球蛋白含量相關的位點位于3A染色體的 Xbarc86-Xwmc21區(qū)間內(nèi)，在本研究中定位的 QGlo3A位點，標記在與之相鄰的Xwmc21-Xwmc664區(qū)間內(nèi)。本研究結果與前人的研究并沒有找到控制相同性狀的同一位點，可能是我們采用的群體和標記不同。

在植物中，不僅基因與基因間存在互作效應，在基因與環(huán)境間也存在互作效應，在不同的遺傳背景和不同的環(huán)境條件下，找到穩(wěn)定表達的QTL是十分困難的[22-23]。一些可在多年多點都可以檢測到且貢獻率大于10%的穩(wěn)定QTL，可以應用于小麥分子標記輔助選擇育種和聚合育種。其中，非條件 QAlu7B-1在5個環(huán)境下的T2時期被檢測出，3個環(huán)境的T3時期被檢測， QAlu1B-3在6個環(huán)境下的T4和T5時期均被檢測出。條件 QAlu1B-3在6個環(huán)境的2個時期中被檢測到。球蛋白的定位結果中，非條件QTL位點在4個環(huán)境下的第1個時期被檢測出，增效基因來自父本豫麥57，同時在條件QTL中有4個環(huán)境中被檢測到。說明， QAlu1B-3和 QGlo1B-3可作為主效位點進行后期驗證。