非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展

趙裕歡 陳東來 陳勇兵

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%，隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的迅速發(fā)展，晚期NSCLC的5年生存率仍舊無法突破20%。即使是腫瘤完整切除的I期NSCLC患者，術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的幾率仍然高達(dá)25%-30%[1,2]，這些患者有可能早期就發(fā)生了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移（micrometastasis）。微轉(zhuǎn)移已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3-5]。近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的空前進(jìn)展，對(duì)微轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)入了分子水平，這使得更快、更精確地檢測(cè)微轉(zhuǎn)移成為可能。

1 微轉(zhuǎn)移的定義

腫瘤的微轉(zhuǎn)移，又稱隱匿性轉(zhuǎn)移，即癌細(xì)胞擴(kuò)散至全身各個(gè)組織、器官，但尚未形成顯性的腫瘤結(jié)節(jié)，也未產(chǎn)生臨床癥狀。在臨床上，常規(guī)病理方法或計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）等影像學(xué)檢查經(jīng)常用于檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移，但卻無法檢測(cè)出骨髓、外周血、淋巴結(jié)中的微轉(zhuǎn)移[6]。

在淋巴結(jié)中檢測(cè)到單個(gè)腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞簇的最大直徑＜0.2 mm即淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移[7]。這就為肺癌的術(shù)后復(fù)發(fā)提供了一種新的解釋。由于評(píng)估術(shù)中清除淋巴結(jié)的技術(shù)的限制，如被正常細(xì)胞掩蓋，小簇的腫瘤細(xì)胞容易被遺漏。因此，需要運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行更加完善的檢測(cè)。

2 微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法及標(biāo)記物

檢測(cè)微轉(zhuǎn)移的最常用方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）和免疫組織化學(xué)染色（immunehistochemistry, IHC）。①PCR可作為檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。PCR是大量擴(kuò)增微量目的DNA片段的方法。它具有高度特異性、敏感性、高產(chǎn)率、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，因此在分子生物學(xué)研究中，PCR迅速地得到了廣泛的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR, RT-PCR）是目前較為常用的檢測(cè)方法。RT-PCR是目前分析已知序列的RNA以及獲取目的基因的最有效方法之一。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的靈敏度可高達(dá)10-5-10-7。但其缺點(diǎn)是RNA在外周環(huán)境中易被污染，因而可能會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。PCR常用的標(biāo)記物有肺組織特異性蛋白（lung-specific X protein, LUNX）、粘蛋白-1（mucin 1, MUC1）和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）等。②IHC是檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的經(jīng)典方法，因其方法相對(duì)簡(jiǎn)便、精確度高的優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛應(yīng)用，但是缺點(diǎn)是特異性較低。IHC是基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法，使用標(biāo)記的抗體在組織或細(xì)胞對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)。隨著路德維希癌癥研究所[8]和皇家馬斯登醫(yī)院的先導(dǎo)研究，運(yùn)用IHC檢測(cè)微轉(zhuǎn)移開始興起，在肺癌領(lǐng)域也有大量研究[9]。IHC常用的標(biāo)記物有細(xì)胞角蛋白（cytokeratin,CK）、細(xì)胞角蛋白抗體AE1/AE3及Ber-EP4等。CKs廣泛分布于上皮細(xì)胞源性腫瘤，因而CK抗體可檢測(cè)不同類型癌癥的隱匿性轉(zhuǎn)移[10,11]。然而，CKs不僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而且在正常上皮細(xì)胞也有表達(dá)，這就意味著在非腫瘤細(xì)胞中可能會(huì)出現(xiàn)假陽性。AE1/AE3抗體是AE1單克隆抗體與AE3單克隆抗體的混合物，兩者可分別識(shí)別細(xì)胞角蛋白I和細(xì)胞角蛋白II。Dai等[12]選取了235例I期肺腺癌患者，用AE1/AE3作為標(biāo)記物，通過IHC進(jìn)行研究，結(jié)果有35例（15%）患者有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。③此外，尚有流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry, FCM）、Cellsearch檢測(cè)系統(tǒng)、蛋白免疫印跡（Western blot）等檢測(cè)方法（表1）。

3 發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素

Zhang等[13]選取54例常規(guī)病理檢查I期NSCLC患者108枚淋巴結(jié)和10例肺良性病變患者20枚淋巴結(jié)進(jìn)行IHC染色檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose-regulated protein 94,GRP94），結(jié)果GRP94陽性率分別為20.4%和0，說明GRP94與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。有研究[14]指出在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，nm23表達(dá)陽性組淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率比陰性組高，證明nm23是發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的因素之一。上皮鈣粘蛋白（epithelial cadherin, E-cad）具有抑制轉(zhuǎn)移的作用，E-cad低表達(dá)有可能是發(fā)生微轉(zhuǎn)移的因素之一。研究認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）與腫瘤發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移有關(guān)。李軍等[15]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺癌組織中VEGF-C的表達(dá)明顯比正常肺組織中高（54.55%vs14.55%），并指出發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的肺癌組織中VEGF-C的表達(dá)明顯比無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的肺癌組織中高，VEGF-C可能參與了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)過程。Kazakydasan等[16]通過研究證明VEGF-C高表達(dá)在一定程度上促進(jìn)了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移還與腫瘤的大小有關(guān)。Veeramachaneni等[17]選取297個(gè)臨床I期肺癌病例，通過邏輯回歸分析指出腫瘤組織直徑每增大1 cm，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率就增大約3倍。CT是目前診斷肺癌的重要手段之一。一些影像學(xué)征象存在時(shí)，如淋巴結(jié)增大、淋巴結(jié)邊緣不規(guī)則強(qiáng)化、淋巴結(jié)中心低密度壞死等，檢測(cè)出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的幾率更高。

2011年，國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（International Association For The Study of Lung Cancer, IASLC）、美國(guó)胸科學(xué)會(huì)（American Thoracic Society, ATS）和歐洲呼吸學(xué)會(huì)（European Respiratory Society, ERS）發(fā)布了以5種常規(guī)組織學(xué)成分為依據(jù)的新腺癌分型，以此來更加精確地評(píng)估預(yù)后[18]。有研究[1]顯示，在5種分型中，以微乳頭成分為主的腺癌類型復(fù)發(fā)率最高，生存率最低，而淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移也在此類型中較多見。Kamiya等[19]根據(jù)微乳頭狀成分比例，將383例腺癌患者分成4組，研究表明，與無微乳頭狀成分組相比，微乳頭狀腺癌組的無病生存期（disease free survival, DFS）和總生存期（overall survival,OS）都更差。此外，尚未有證據(jù)顯示肺腺癌與肺鱗癌中淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率存在差異。

4 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移在臨床上的作用

IASLC在2015年發(fā)布了第八版肺癌腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期，更加細(xì)分了肺癌的分期標(biāo)準(zhǔn)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移廣泛應(yīng)用于TNM分期中，評(píng)估患者預(yù)后和指導(dǎo)臨床診療。一些研究表明，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移同樣可以作為一個(gè)獨(dú)立的影響因素起指導(dǎo)作用。Deng等[3]指出，在NSCLC中，有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的兩倍。有數(shù)據(jù)[12]顯示淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者的5年生存率為39%，總生存率為62%，低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的80%與88%。

表1 微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法及標(biāo)記物Tab 1 Detection methods and markers for micrometastasis

4.1 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)手術(shù)方式選擇的影響 肺腫瘤切除伴縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)被認(rèn)為是早期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。I期NSCLC患者接受淋巴結(jié)清掃者相較于未清掃淋巴結(jié)者有著更高的總生存期和無病生存期。但是，完整清除縱隔淋巴結(jié)是否能提高生存率仍然存在爭(zhēng)議。淋巴結(jié)的清掃方式目前有3種，包括系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃（systematic nodal dissection, SND）、淋巴結(jié)采樣（lymph nodal sampling, LNS）和肺葉特異性淋巴結(jié)清掃（lobespecific nodal dissection, L-SND）。而不同清掃方式的清掃范圍尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[20,21]。

淋巴結(jié)的檢測(cè)方法決定了癌癥病理分期的質(zhì)量，SND能夠較為精確地為術(shù)后分期提供依據(jù)。SND本身是否能夠提高生存率存在爭(zhēng)議，有研究[22,23]認(rèn)為SND僅對(duì)分期有作用，而對(duì)患者術(shù)后的生存期并無太大的作用。但是有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)SND降低了局部復(fù)發(fā)的幾率。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生是其中一種原因，有理由推測(cè)，SND能清除隱匿性微轉(zhuǎn)移，從而阻止局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。L-SND的定義最初是在2006年由歐洲胸外科學(xué)會(huì)提出來的[24]。Meng等[25]指出，對(duì)于早期NSCLS患者的預(yù)后，L-SND并不劣于SND，兩者均優(yōu)于LNS。L-SND由于能帶來更小的手術(shù)創(chuàng)傷并減輕患者痛苦而逐漸受到認(rèn)可，但是L-SND在檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移上較為困難。

兩種淋巴結(jié)清掃方式可根據(jù)術(shù)中檢測(cè)是否有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移來選擇，依照淋巴引流規(guī)律，區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性時(shí)可采用SND，而淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陰性時(shí)則可采用L-SND，再一次證明檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的重要性。Keller等[26]研究表明SND對(duì)淋巴結(jié)N2檢出率明顯優(yōu)于LNS。Melfi等[27]研究發(fā)現(xiàn)右肺下葉的淋巴結(jié)N2轉(zhuǎn)移率最高，而SND可有效規(guī)避微轉(zhuǎn)移及跳躍轉(zhuǎn)移。據(jù)研究[28,29]報(bào)道，術(shù)中清掃更多的淋巴結(jié)，對(duì)患者的預(yù)后更有利。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移在清掃淋巴結(jié)多的病例中檢出率更高。因此，行亞肺葉切除術(shù)或肺葉切除術(shù)者可適當(dāng)增加淋巴結(jié)清掃數(shù)目。LNS是僅依靠術(shù)中觀察、觸覺等主觀感覺清掃可疑的淋巴結(jié)，其清掃淋巴結(jié)數(shù)量較少，因而淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率較低。

4.2 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與病理分期的關(guān)系 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)病理分期有一定的意義。Izbicki等[30]選取了腫瘤完整切除的常規(guī)病理pN0和pN1期共93例NSCLC患者與36例pN2期NSCLC患者，并使用單克隆抗體Ber-Ep4作為標(biāo)記物使用IHC檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)72例pN0患者中有20例（27.4%）檢測(cè)出存在微轉(zhuǎn)移，20例pN1患者中9例（45.0%）有微轉(zhuǎn)移。無論pN0還是pN1患者，無微轉(zhuǎn)移者均較微轉(zhuǎn)移者DFS長(zhǎng)。研究得出結(jié)論：有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移存在的pN0和pN1患者的生存期與pN2患者的生存期并無差別。Qiu等[31]對(duì)193枚NSCLC的淋巴結(jié)進(jìn)行微轉(zhuǎn)移檢測(cè)，再根據(jù)結(jié)果重新進(jìn)行TNM分期，得出結(jié)論：從I期提升至II期的患者有2例，從II期提升至III期的患者有6例。有研究[32]指出，腫瘤的T分期越晚，發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的幾率越高，術(shù)后復(fù)發(fā)的幾率也增高。目前的常規(guī)病理分期并未將淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移考慮在內(nèi)，對(duì)患者的疾病情況無法作出更精確地反映。但淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是否應(yīng)作為病理分期的參考因素，目前尚未有定論。

4.3 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響 疾病累及淋巴結(jié)是影響OS、DFS、復(fù)發(fā)率（recurrence rate, RR）的因素之一。通過分析（表2）發(fā)現(xiàn)，大量研究證明淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)NSCLC患者的預(yù)后會(huì)產(chǎn)生不利影響，僅有少數(shù)研究認(rèn)為兩者關(guān)系不明確?？梢姡壳暗挠^點(diǎn)傾向于淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是發(fā)生不良預(yù)后的原因之一。

表2 近十年肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究匯總Tab 2 Summary of the research in lymph node micrometastasis of lung cancer in recent ten years

5 展望

目前的臨床實(shí)踐證明，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床重要性尚未得到充分重視，是否需要將淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移作為肺癌臨床分期的一個(gè)因素，有待進(jìn)一步研究。標(biāo)記物的種類繁多，但尚未有公認(rèn)的理想標(biāo)記物，因此，未來研究的一個(gè)重要方向就是發(fā)現(xiàn)一種敏感性、特異性高的分子標(biāo)記物。提高淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)水平，對(duì)腫瘤分期、指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估預(yù)后有重要作用。對(duì)于檢測(cè)出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的患者的下一步治療有待討論，存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的Ia期患者是否應(yīng)在術(shù)后進(jìn)行輔助化療及化療后是否對(duì)患者有益尚無定論。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響尚存在爭(zhēng)議。術(shù)中冰凍病理對(duì)微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的作用尚未有結(jié)論。行肺葉切除術(shù)和亞肺葉切除術(shù)對(duì)術(shù)后病理提示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的Ia期肺癌治療效果有待對(duì)比研究。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)各病理類型肺癌產(chǎn)生的作用是否相似尚不明確。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)是否遵循肺葉特異性淋巴引流規(guī)律，及其帶來的對(duì)選擇手術(shù)方式的影響尚有待更多研究成果。