應(yīng)用基于LC—TOF—MS分析的質(zhì)量虧損過(guò)濾方法篩選黃芪注射液中的皂苷類成分

宋慧婷+李長(zhǎng)印+萬(wàn)瑤瑤+丁選勝+譚喜瑩+戴國(guó)梁+劉史佳+居文政

[摘要] 采用液相色譜與四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)分析黃芪注射液（HI）樣品，獲取正負(fù)離子模式下HI中化學(xué)成分的LC-TOF-MS分析數(shù)據(jù)。根據(jù)前期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，建立黃芪皂苷類化合物的質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）方法，用于系統(tǒng)篩選HI中所含有的皂苷類成分。每個(gè)篩選化合物的存在需由不少于2個(gè)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行確認(rèn)。最后依據(jù)其母離子和子離子信息對(duì)所篩選的化合物進(jìn)行初步鑒定。最終共從HI中篩選并初步鑒定出62個(gè)皂苷類化合物，其中15個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的皂苷類化合物。鑒定結(jié)果提示，乙?；?、氫化、去氫化、甲氧基化和水化可能為HI中皂苷所涉及的主要轉(zhuǎn)化反應(yīng)。該研究豐富了黃芪化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，同時(shí)也表明基于LC-TOF-MS分析的MDF方法，是一種可行且有效的中藥成分系統(tǒng)篩選工具。

[關(guān)鍵詞] 黃芪注射液； 黃芪皂苷； 質(zhì)量虧損過(guò)濾； LC-TOF-MS； 轉(zhuǎn)化反應(yīng)

[Abstract] The samples of Huangqi injection （HI） were analyzed by liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （LC-TOF-MS）， and both positive and negative ion modes were employed to obtain the LC-TOF-MS analysis information of chemical compounds in HI. Then the mass defect filtering （MDF） approach， which was developed based on the previously published articles， was utilized to rapidly screen the astragalosides from the obtained LC-TOF-MS data. Each screened astragaloside was confirmed by the presence of no less than 2 quasi-molecular ions. All the screened astragalosides were then tentatively assigned according to the parent ion and daughter ion information. Finally， a total of 62 astragalosides were screened and characterized from the HI samples， including 15 new detected ones. The identification results indicated that acetylation， hydrogenation， dehydrogenation， methoxylation and hydration might be the major conversion reactions involved in the formation of the astragalosides. The LC-TOF-MS-based MDF approach was proved to be a feasible and efficient tool to screen the chemical constituents in complex matrices such as herbal medicines.

[Key words] Huangqi injections； astragalosides； mass defect filter； LC-TOF-MS； conversion reactions.

明確中藥中所含有的化學(xué)成分信息，是闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量和安全性的前提和基礎(chǔ)。高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)非常適用于中藥化學(xué)成分定性分析，特別是非目標(biāo)性系統(tǒng)性定性分析[1-2]。然而，由于中藥成分復(fù)雜，其LC-TOF-MS分析數(shù)據(jù)信息異常豐富，如何對(duì)其快速有效解析，以準(zhǔn)確全面地提取中藥成分信息一直是研究者的一大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，質(zhì)量虧損過(guò)濾（mass defect filtering，MDF）方法作為一種TOF-MS等高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的新型數(shù)據(jù)處理技術(shù)，已被一些研究證明可用于中藥成分的系統(tǒng)分析，并具有一定的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3-4]。然而這些研究均具有一定的局限性，它們或者需要對(duì)照品比對(duì)[3]，或者沒(méi)有考慮到化合物可能的加合離子[4]。黃芪注射液（HI）為已上市的臨床常用黃芪制劑，皂苷類為其主要藥效成分和制劑質(zhì)量控制指標(biāo)[5-6]。然而目前還沒(méi)有對(duì)HI中皂苷類成分系統(tǒng)分析的研究報(bào)道?；诖耍狙芯拷Y(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，充分考慮皂苷類化合物可能產(chǎn)生的各種加合離子，建立了改進(jìn)的黃芪皂苷類化合物的質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）方法，對(duì)HI中的皂苷類成分進(jìn)行系統(tǒng)篩選和鑒定。

1 材料

LC （Agilent）-（AB） Triple TOFTM 5600液質(zhì)聯(lián)用儀，含Pump Agilent 1200G1312A，Column Oven Agilent 1200G1316A，Auto Sampler Agilent 1260G1367B和Triple TOF 5600 Mass spectrometer，LC-MS/MS系統(tǒng)由Analyst 1.6 Software 控制；CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；高速低溫離心機(jī)（ThermoSorvall Legend Micro 17R）；WH2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司）；甲酸、甲酸銨（質(zhì)譜級(jí)，瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司）；超純水由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)制備；其余試劑為分析純。黃芪注射液為正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1212053，規(guī)格10 mL/支。TOF-MS正負(fù)離子調(diào)諧液（美國(guó)AB Sciex公司，產(chǎn)品編號(hào)分別為4460131，4460134）。Oasis@固相萃?。⊿PE）小柱（HLB 3cc，美國(guó)Waters公司）。

2 方法

2.1 樣品處理 黃芪注射液經(jīng)SPE處理后方可進(jìn)行LC-TOF-MS分析。HLB型SPE小柱使用前需首先用3 mL甲醇活化，而后用3 mL水洗預(yù)平衡。將黃芪注射液渦旋30 s混勻，精密吸取600 μL上SPE小柱，而后用2 mL水洗除雜，待水洗完畢后用1 mL甲醇進(jìn)行洗脫。將甲醇洗脫液渦旋30 s混勻，12 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2.2 色譜條件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18預(yù)柱（3.0 mm×5.0 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的水相，B為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的等比混合的甲醇-乙腈；梯度洗脫（0～0.5 min，5% B；0.5～12 min，5%～100% B；12～16 min，100% B；16～16.1 min，100%～5% B；16.1～22 min，5% B）；流速300 μL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；進(jìn)樣室溫度8 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化（ESI）源，正負(fù)離子模式均用于數(shù)據(jù)采集。TOF-MS掃描模式參數(shù)設(shè)置如下：掃描范圍 m/z 100～1 000，累積時(shí)間 0.250 015 s，離子化溫度（TEM） 550 ℃，霧化氣（GS1） 60 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助加熱氣（GS2） 60 psi，氣簾氣（CUR） 35 psi，去簇電壓（DP） 80 V，碰撞能量（CE） 10 eV，正負(fù)離子模式下噴霧電壓（ISVF）分別為5 500，4 500 V。采用IDA，DBS和高靈敏度的模式采集數(shù)據(jù)。主要的IDA轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)如下：信號(hào)強(qiáng)度大于500 cps，4以內(nèi)排除同位素，相對(duì)分子質(zhì)量誤差0.05，每個(gè)循環(huán)最多監(jiān)測(cè)8個(gè)候選離子。子離子掃描模式的參數(shù)設(shè)置如下：掃描范圍 m/z 50～1 000，累積時(shí)間0.100 006 s，CE（35±15） eV，其他主要參數(shù)同TOF-MS掃描模式。采用AB公司的調(diào)諧液傳遞系統(tǒng)（CDS）對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量準(zhǔn)確度進(jìn)行自動(dòng)校準(zhǔn)。通過(guò)AB公司的軟件Analyst TF 1.6 software控制儀器操作和數(shù)據(jù)采集。

2.4 數(shù)據(jù)分析 采用AB公司的軟件Peakview Software TM v. 1.2對(duì)獲得LC-TOF-MS分析數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)處理過(guò)程會(huì)用到Peakview軟件的4個(gè)功能Mass Defect Filtering （MDF），F(xiàn)ormula Finder，XIC manager和IDA Explorer。

首先，采用MDF功能篩選黃芪皂苷相關(guān)特征離子，質(zhì)量虧損和相對(duì)分子質(zhì)量篩選范圍見(jiàn)表1，正負(fù)離子模式下離子信號(hào)強(qiáng)度下限分別為12 000，7 000 cps。僅在IDA Explorer項(xiàng)下篩選能產(chǎn)生子離子的特征離子，以方便后續(xù)鑒定過(guò)程。接著，利用Formula Finder功能對(duì)篩選所得目標(biāo)離子的元素組成進(jìn)行預(yù)測(cè)，主要參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1，此外相對(duì)分子質(zhì)量最大允許誤差5，正離子模式下氮、鈉和鉀原子0～1個(gè)，負(fù)離子模式下氮、氯原子0～1個(gè)。采用XICManager功能提取篩選所得的目標(biāo)離子，以檢驗(yàn)其

峰形完整性，確認(rèn)其準(zhǔn)確保留時(shí)間；在0.03 min的 保留時(shí)間允許誤差范圍內(nèi)，匹配、合并源自1個(gè)化合物的多個(gè)特征準(zhǔn)分子離子（如正離子模式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+K]+，[M+NH4]+，及負(fù)離子模式下的[M-H]-，[M+Cl]-，[M+HCOOH-H]-，[M+NO3]-等），并對(duì)其他可能的上述特征離子進(jìn)行XIC提取確認(rèn)，進(jìn)而綜合各種加合離子信息鎖定目標(biāo)化合物。同時(shí)，對(duì)于同一時(shí)間點(diǎn)所篩選到的多個(gè)目標(biāo)化合物，仔細(xì)考察相互間的分子式/相對(duì)分子質(zhì)量關(guān)聯(lián)，以去除源于源內(nèi)裂解離子的假陽(yáng)性篩選結(jié)果。最后，結(jié)合IDA Explorer提供的子離子信息對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行初步鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 分析條件的選擇 本研究中選擇的Poroshell 120 SB-C18色譜柱為Agilent公司開(kāi)發(fā)的一類新型UPLC色譜柱，與亞2 μm柱具有相似的高柱效，但壓力減少40%～50%，因此適用于Agilent 1200等常壓液相色譜[7]。為了能與后續(xù)HI藥效相關(guān)非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究進(jìn)行銜接，并證明本文中MDF篩選方法的篩選能力和效率，未對(duì)洗脫梯度等分析條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，選擇了代謝組學(xué)研究中采用的通用的分析條件（詳見(jiàn)后續(xù)研究報(bào)道）；流動(dòng)相中加入甲酸和甲酸銨是為了提高離子化效率、改善色譜峰峰形和產(chǎn)生特征加合離子。正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)以產(chǎn)生豐富的加合離子確證目標(biāo)化合物的存在，并提供豐富的碎片離子以利化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。

3.2 MDF篩選方法的確定 MDF技術(shù)最初是用于代謝產(chǎn)物鑒定研究的，用來(lái)移除生物樣本中大量的背景干擾離子[8-9]。而中藥成分雖然十分復(fù)雜，但常?？蓺w屬為一類或幾類具有相同結(jié)構(gòu)母核的一系列化合物，他們可以看做（實(shí)際上也應(yīng)該是）極少數(shù)幾個(gè)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)母核的化合物的次生代謝產(chǎn)物，這與藥物及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的關(guān)系是類似的，因此MDF技術(shù)理應(yīng)適用于中藥成分的系統(tǒng)定性分析。本研究中，MDF方法的質(zhì)量虧損和相對(duì)分子質(zhì)量篩選范圍的設(shè)定依據(jù)為已有文獻(xiàn)報(bào)道的黃芪皂苷類化合物。先前研究中，根據(jù)24個(gè)已有報(bào)道的黃芪中皂苷類成分的分子式，借助Peakview軟件的Mass calculator功能計(jì)算獲得其5種常見(jiàn)準(zhǔn)分子離子包括正離子模式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+NH4]+及負(fù)離子模式下的[M-H]-，[M+HCOOH-H]-的精確分子質(zhì)量；據(jù)此得到正負(fù)離子模式下質(zhì)量虧損的最大值和最小值，以及相對(duì)分子質(zhì)量的最大值和最小值，進(jìn)而設(shè)定了MDF的相關(guān)參數(shù)[10]。然而，由篩選結(jié)果可知，[M+HNO3-H]-為此前未見(jiàn)報(bào)道的一種出現(xiàn)頻率極高的黃芪皂苷準(zhǔn)分子離子，其出現(xiàn)頻率僅次于[M+HCOOH-H]-；此外，[M+K]+和[M+Cl]–也經(jīng)常出現(xiàn)。更為重要的是，相比[M-H]-和[M+H]+離子，多數(shù)情況下，黃芪皂苷的[M+HCOOH-H]-，[M+Na]+和[M+HNO3-H]-等加合離子往往具有更強(qiáng)的離子響應(yīng)強(qiáng)度。篩選方法設(shè)定時(shí)不考慮這些準(zhǔn)分子離子的存在會(huì)影響篩選方法的靈敏度和篩選結(jié)果的全面性。因此，根據(jù)各個(gè)已有報(bào)道的皂苷的上述所有8種準(zhǔn)分子離子的精確相對(duì)分子質(zhì)量和分子式，對(duì)上述MDF方法進(jìn)行了修正，從而大大提高了化合物篩選的靈敏度。由于CDS自動(dòng)校準(zhǔn)可以實(shí)現(xiàn)0.01以內(nèi)的分子質(zhì)量自動(dòng)校準(zhǔn)，因此將質(zhì)量虧損的誤差范圍設(shè)定為±0.01；而分子質(zhì)量誤差范圍則設(shè)定為10，以涵蓋可能出現(xiàn)的不可預(yù)知的皂苷類化合物。最終MDF方法具體參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。

3.3 篩選結(jié)果 經(jīng)MDF過(guò)濾后的LC-TOF-MS總離子流色譜圖（TIC）的基線噪音水平顯著降低，而黃芪皂苷類化合物對(duì)應(yīng)的色譜峰也在TIC圖譜中更加清晰明顯，見(jiàn)圖1。理論上來(lái)講，凡是質(zhì)量虧損落在設(shè)定范圍內(nèi)的信號(hào)離子均應(yīng)作為皂苷相關(guān)離子被篩選出來(lái)進(jìn)一步研究。而在本研究中，僅對(duì)能產(chǎn)生子離子且信號(hào)強(qiáng)度在12 000 cps（正離子模式）或7 000 cps（負(fù)離子模式）以上的皂苷相關(guān)離子進(jìn)行篩選，以發(fā)現(xiàn)相對(duì)含量較高的黃芪皂苷類成分。最終根據(jù)1.2.4中所述方法，共從黃芪注射液中鎖定62個(gè)皂苷類化合物。

a.正離子模式下未過(guò)濾的TIC；b.負(fù)離子模式下未過(guò)濾的TIC；c.正離子模式下經(jīng)皂苷類MDF方法濾過(guò)的TIC；d.負(fù)離子模式下經(jīng)皂苷類MDF方法濾過(guò)的TIC。

為了進(jìn)一步確證62個(gè)皂苷類成分的存在，采用XIC manager重新提取了每個(gè)成分的8種準(zhǔn)分子離子的XIC圖譜，以確證各種準(zhǔn)分子離子的存在。結(jié)果表明，大多數(shù)皂苷類成分均存在3個(gè)以上的準(zhǔn)分子離子，進(jìn)一步證明了篩選結(jié)果的可靠性。各種離子類型出現(xiàn)的頻率從高到低依次為：[M+HCOOH-H]->[M+Na]+>[M+NO3]->[M-H]->[M+H]+>[M+Cl]->[M+K]+>[M+NH4]+。由此可見(jiàn)，在當(dāng)前LC-MS條件下，[M+HCOOH-H]-是負(fù)離子模式下黃芪皂苷類化合物最常見(jiàn)的離子形式，而[M+Na]+則是正離子模式下黃芪皂苷的主要離子形式。此結(jié)果進(jìn)一步證明了化合物篩選方法時(shí)考慮各種類型加合離子的重要性和必要性。總結(jié)62個(gè)化合物的詳細(xì)信息，見(jiàn)表2，包括保留時(shí)間，分子式，不飽和度，5類主要準(zhǔn)分子離子的分子質(zhì)量測(cè)定值及其與理論值間的誤差值，[M+HCOOH-H]-的信號(hào)強(qiáng)度，以及各化合物與已知黃芪皂苷的元素組成的關(guān)聯(lián)性。

3.4 篩選化合物的鑒定 化合物的鑒定主要依據(jù)其元素組成與已報(bào)道的黃芪皂苷類化合物間的聯(lián)系，子離子色譜圖的特征診斷離子以及chemspider等已知化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。由前期研究[11]可知，在全掃描（TOF-MS scan type）模式下，皂苷類在正離子狀態(tài)下極易產(chǎn)生苷元診斷碎片離子離子m/z 473.362 0 （C30H49O4），和一系列進(jìn)一步脫水離子峰m/z 455.352 0 （C30H47O3），437.341 0 （C30H45O2），419.331 0 （C30H43O），以及C-17和C-20鍵裂解產(chǎn)生的25-hydroxy-20，24-epoxy殘基離子m/z 143.106 0 （C8H15O2），這些離子的大量出現(xiàn)可為皂苷類化合物的存在提供依據(jù)，但是也會(huì)導(dǎo)致其相應(yīng)準(zhǔn)分子離子峰的信號(hào)大幅度減弱乃至缺失，從而無(wú)法獲取針對(duì)某一離子的準(zhǔn)確子離子信息。相反，在負(fù)離子狀態(tài)下，黃芪皂苷類化合物在全掃描模式下往往僅產(chǎn)生豐度較強(qiáng)的[M-H]-或[M+HCOOH-H]-等準(zhǔn)分子離子峰。這些準(zhǔn)分子離子峰在子離子模式（product ion scan type）下則可產(chǎn)生源自此指定母離子的系列特征子離子，用于皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。研究發(fā)現(xiàn)[10]，黃芪甲苷（AGIV）在負(fù)離子TOF-MS模式下主要以m/z 829.459 8[M+HCOOH-H]-存在，此離子可在子離子模式產(chǎn)生m/z 783.456 4，651.410 4，621.398 1，489.357 0，179.056 1，161.045 6，149.045 8，143.034 1，131.034 1，119.035 6，113.024 7，101.024 9，89.0252，71.015 2，59.015 1等一系列特征離子，對(duì)應(yīng)皂苷結(jié)構(gòu)母核中的不同結(jié)構(gòu)特征，見(jiàn)圖2a。類似地，所有皂苷類化合物均可產(chǎn)生類似的特征碎片離子，見(jiàn)表3，據(jù)此可以初步描述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行合理歸屬。以A13為例，見(jiàn)圖2b，其[M+HCOOH-H]-可產(chǎn)生一系列特征碎片離子用于化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析。與黃芪甲苷一樣，碎片離子179.06和149.05的出現(xiàn)表明A13結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖殘基和木糖殘基，而59.02和71.02的存在則表明A13結(jié)構(gòu)中25-hydroxy-20，24-epoxy殘基離子；離子505.4，637.4，667.4和黃芪甲苷的苷元特征離子489，621，651均相差1個(gè)氧原子的相對(duì)分子質(zhì)量，提示羥基應(yīng)存在于皂苷元母核上，而非其他3個(gè)環(huán)上。離子799的出現(xiàn)進(jìn)一步證明845為A13的[M+HCOOH-H]-，且A13應(yīng)為黃芪甲苷的羥基化產(chǎn)物。據(jù)此，給出A13的可能化學(xué)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2c。類似地，對(duì)所有62個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合理歸屬，見(jiàn)圖3。其中共有47個(gè)已有報(bào)道的黃芪皂苷成分及其同分異構(gòu)體，其中包含8個(gè)AGIV同分異構(gòu)體（A15，A18，A22，A26，A37，A41，A48，A49），9個(gè)AGII同分異構(gòu)體（A31，A35，A45，A50，A51，A53，A56，A57，A60），3個(gè)AGI同分異構(gòu)體（A58，A61，A62），6個(gè)AGV同分異構(gòu)體（A16，A17，A20，A34，A39，A44），乙酰AGI（A63），大豆皂苷（A40），以及19個(gè)先前黃芪口服液中首次發(fā)現(xiàn)的黃芪皂苷類化合物[10]；包括A13在內(nèi)的剩余15個(gè)化合物則為黃芪注射液中新發(fā)現(xiàn)的黃芪皂苷類化合物。歸屬所有62個(gè)新化合物的可能化學(xué)結(jié)構(gòu)所需的子離子信息見(jiàn)表3。

a.負(fù)離子模式下黃芪甲苷（AGIV）的主要裂解途徑及特征子離子；b.A13的母離子 [M+HCOOH-H]-m/z 845.5的子離子圖譜；c.A13可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3.5 篩選結(jié)果分析 根據(jù)篩選鑒定出的62個(gè)皂苷類化合物，可以對(duì)黃芪注射液中皂苷類成分的轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行總結(jié)歸納。假設(shè)黃芪皂苷的轉(zhuǎn)化始于AGIV，其他化合物則可看作是AGIV通過(guò)某些轉(zhuǎn)化反應(yīng)而生成的產(chǎn)物。事實(shí)上，已知的主要皂苷類成分AGII，AGI和AGV也可以分別看作是AGIV發(fā)生1，2，3次乙?；蟮玫降南盗修D(zhuǎn)化產(chǎn)物。結(jié)果表明，共有乙酰化、（去）甲氧基化、（去）氫化、水合反應(yīng)等9種轉(zhuǎn)化反應(yīng)參與黃芪皂苷類化合物的生成，見(jiàn)圖3。結(jié)合各化合物[M+HCOOH-H]-的離子強(qiáng)度，可以初步認(rèn)為，乙?；?、甲氧基化、氫化、去氫化和水合反應(yīng)是黃芪注射液中黃芪皂苷類成分的主要轉(zhuǎn)化途徑。參考已知的主要皂苷類成分AGII，AGI和AGV的化學(xué)結(jié)構(gòu)[11-13]，以及ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)構(gòu)類似的化合物，結(jié)合常規(guī)轉(zhuǎn)化反應(yīng)規(guī)律，初步推斷可能的主要反應(yīng)位點(diǎn)如下：AGIV結(jié)構(gòu)中的A環(huán)被認(rèn)為是乙?；图籽趸目赡芊磻?yīng)位點(diǎn)，而氫化反應(yīng)可能發(fā)生于C9-C19位開(kāi)環(huán)，去氫化則可能是C16位羥基羰基化，水合反應(yīng)最有可能發(fā)生于C20-C24環(huán)氧基團(tuán)。需要指出的是，并無(wú)確切證據(jù)證實(shí)AGIV為所有黃芪皂苷的母體化合物，因此上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在實(shí)際情況下有可能是逆向發(fā)生的。此外，本研究中未檢測(cè)到丙二酸鹽類皂苷成分，AGI的同分異構(gòu)體及先前研究中未鑒定的1種皂苷成分，這些化合物的缺失可能與黃芪注射液的制備工藝有關(guān)。

1.乙?；?.去氫化；3.氫化；4.水合；5.甲氧基化；6.去羥基化；7.糖基化；8.羥基化；9.去甲氧基化。

4 結(jié)論

本研究在對(duì)HI進(jìn)行LC-TOF-MS分析獲取分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用MDF篩選方法共從HI中篩選出62個(gè)皂苷類化合物，其中15個(gè)為新發(fā)現(xiàn)化合物。

研究結(jié)果充分證明了基于LC-TOF-MS分析的MDF篩選方法應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)定性分析的可行性和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，篩選出的62個(gè)皂苷類化合物間接闡明了HI中的黃芪皂苷次生代謝產(chǎn)物種類，豐富了對(duì)于黃芪皂苷類成分多樣性的認(rèn)識(shí)，對(duì)于科學(xué)評(píng)價(jià)黃芪制劑質(zhì)量、促進(jìn)制劑合理開(kāi)發(fā)均具有一定的指導(dǎo)意義。

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