解卷積定量核磁共振法測(cè)定黃芪注射液中8種初生代謝成分

陳燕燕等

摘要 應(yīng)用質(zhì)子核磁共振技術(shù)（1HNMR）結(jié)合解卷積的峰提取方法，建立了中藥黃芪注射液中氨基酸、有機(jī)酸類和糖類等8種初生代謝成分的含量檢測(cè)方法。注射液樣品經(jīng)冷凍干燥后精密稱取10 mg，加入0.6 mL D2O（含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL）用于NMR測(cè)試。根據(jù)1HNMR指紋譜，從黃芪注射液中鑒定出20種初生和4種次生代謝成分。應(yīng)用解卷積法提取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的定量峰，然后進(jìn)行峰面積積分，并采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各個(gè)成分的含量。在給定濃度范圍內(nèi)，8種成分呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)（R2>0.9990），精密度 RSD<3.8%，重現(xiàn)性RSD<2.7%，穩(wěn)定性RSD<4.5%，回收率為91.4%～102.7%。結(jié)果表明，與常規(guī)處理方法相比，解卷積檢峰再積分的方法可降低復(fù)雜體系中質(zhì)子信號(hào)峰的重疊度，獲得更加精確的定量峰積分面積，從而進(jìn)一步提高1HNMR含量分析的準(zhǔn)確度。采用本方法對(duì)5個(gè)廠家共20批黃芪注射液樣品中的8種初生代謝成分進(jìn)行了含量測(cè)定，并運(yùn)用主成分分析法對(duì)不同廠家的樣品進(jìn)行了聚類和區(qū)分。

關(guān)鍵詞；定量核磁共振法； 解卷積； 黃芪注射液； 初生代謝成分

1引言

隨著儀器的發(fā)展，質(zhì)子核磁共振（Nuclear magnetic resonance，1HNMR）技術(shù)目前已逐漸應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域，其特點(diǎn)在于可同時(shí)提供化合物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量測(cè)定的定量信息，因此分析過程無需待測(cè)物對(duì)照品，且樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、不破壞樣品 [1～5]。1HNMR常用定量方法為絕對(duì)內(nèi)標(biāo)定量法，即以含量已知的內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物制成混合溶液同時(shí)測(cè)定圖譜，通過二者峰面積的比值確定待測(cè)物的含量[6]。在對(duì)混合物中的各個(gè)成分進(jìn)行定量分析時(shí)，其關(guān)鍵在于每個(gè)成分定量峰的選擇，通常選擇完全獨(dú)立、無干擾的特征質(zhì)子信號(hào)峰進(jìn)行含量測(cè)定。將1HNMR指紋圖譜技術(shù)引入中藥注射液的化學(xué)成分表征中所面臨的難題是： 1HNMR譜的化學(xué)位移值范圍通常比較窄（δ 0～12），在該區(qū)間內(nèi)質(zhì)子信號(hào)峰相互重疊嚴(yán)重，不易尋找到完全獨(dú)立的信號(hào)峰用于多成分的含量測(cè)定。

解卷積（Global spectral deconvolution，GSD）是一種1HNMR圖譜處理方法，可通過對(duì)全譜反褶積的精確校正鑒別復(fù)雜峰形，從復(fù)雜質(zhì)子信號(hào)中分離出重疊的信號(hào)峰。1HNMR譜在有雜質(zhì)峰、信號(hào)重疊和信噪比不高的情況下，可以使用解卷積提取定量峰計(jì)算積分面積確定化合物的濃度[7]。近來，已有相關(guān)報(bào)道運(yùn)用GSD分析方法對(duì)混合物進(jìn)行定量測(cè)定[8]。

黃芪注射液，益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，養(yǎng)心通脈，健脾利濕。作為臨床常用藥物用于心氣虛損、血脈瘀阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝炎等癥狀，目前共有14家國內(nèi)藥企獲批生產(chǎn)。中國藥典和衛(wèi)生部頒布標(biāo)準(zhǔn)中黃芪藥材和黃芪注射液的定量指標(biāo)成分均為黃芪甲苷[9，10]，并采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪藥材中還存在大量氨基酸、有機(jī)酸、糖類化合物等初生代謝成分[11]，但由于其極性較大，是常規(guī)反相HPLC方法的檢測(cè)盲點(diǎn)。本研究進(jìn)一步運(yùn)用質(zhì)子核磁共振（1HNMR）法對(duì)黃芪注射液中的化學(xué)成分進(jìn)行表征，并應(yīng)用定量1HNMR技術(shù)和解卷積處理方法對(duì)黃芪注射液中的多種初生代謝成分進(jìn)行含量測(cè)定。本研究將解卷積法引入中藥混合體系進(jìn)行含量測(cè)定，并測(cè)定了5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液樣品，比較了不同廠家樣品中初生代謝成分的含量差異。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

BRUKER AVANCEⅢ600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，質(zhì)子激發(fā)頻率600.23 MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀（瑞士Bruker公司）； 5 mm標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管（美國Norell公司）； D2O（氘代度>99.8%， 美國SigmaAldrich公司）； 3（三甲基甲硅烷）丙酸d4鈉鹽（TSP）氘代度>98%（美國SigmaAldrich公司）； 實(shí)驗(yàn)用黃芪注射液為市售產(chǎn)品，規(guī)格為每支裝10 mL，5個(gè)廠家共20批黃芪注射液，分別為QCB（1311102）、ZB（A20120709，A20130206）、SW（131001D2，130324D1，130803D2，130525D2，131116D3，130326D1，130313D2）、DL（1301072，1307222，1309212）、XY（1304023，1310022，1304011，1310031，1310103，1305081，1310072）。

2.21HNMR測(cè)試條件

采用zg30脈沖序列測(cè)定樣品溶液的1HNMR圖譜。測(cè)定溫度298 K，觀測(cè)頻率600.23 MHz，譜寬12019.2 Hz， 90°脈沖寬度13 μs，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間15 s，接受增益128。用TSP信號(hào)定標(biāo)。

2.3樣品的制備

取黃芪注射液樣品于

Symbolm@@ 80℃冰箱中迅速冷凍，再將其放入真空冷凍干燥箱中凍干后精密稱取10 mg， 加入0.6 mL D2O（含內(nèi)標(biāo)TSP 0.02 g/mL），轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，加封直接用于1HNMR測(cè)試。

2.4方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸），置于2 mL容量瓶中，用含有TSP的D2O稀釋到刻度，搖勻，倍比稀釋得到5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，各取0.6 mL置于核磁管中，測(cè)定1HNMR圖譜，記錄各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品定量峰的積分面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2精密度和重復(fù)性取同一份黃芪注射液供試品溶液，在上述2.2項(xiàng)下條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄定量峰積分面積，計(jì)算精密度（RSD值）。取同一批次黃芪注射液供試品溶液6份，上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄定量峰積分面積，計(jì)算重復(fù)性（RSD值）。

2.4.3穩(wěn)定性取同一份黃芪注射液供試品溶液，分別在0， 2， 4， 6， 8， 12和24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄積分面積，記錄定量峰積分面積，計(jì)算RSD值。

2.4.4加樣回收率稱取同一批次黃芪注射液供試品5 mg，共6份； 然后分別稱取乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶解、稀釋到濃度分別為0.08960， 0.9858， 0.4674， 0.2693， 0.4579， 0.3551， 0.0870和0.0289 mg/mL，取混合標(biāo)準(zhǔn)600 μL加入6份供試品中，在上述2.2項(xiàng)下條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄積分面積，計(jì)算回收率。

3結(jié)果與討論

3.11HNMR指紋譜分析

黃芪注射液樣品的1HNMR指紋譜（圖1）質(zhì)子信號(hào)峰分布在δ 0～9.5 之間，其中δ 0.0～3.2 是氨基酸和有機(jī)酸質(zhì)子信號(hào)區(qū)，δ 3.2～5.5 是糖基質(zhì)子信號(hào)區(qū)，δ 5.5～9.5為黃酮類質(zhì)子信號(hào)區(qū)

根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況，并結(jié)合二維核磁相關(guān)信息，共鑒定出24種化學(xué)成分，其中包括4種次生代謝成分： 毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮7 OβD吡喃葡萄糖、芒柄花素、2′羥基3′，4′二甲氧基異黃烷7 OβD吡喃葡萄糖； 20種初生代謝成分： 7種氨基酸（亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、甘氨酸），5種有機(jī)酸（乳酸、乙酸、琥珀酸、丙二酸、甲酸），6種糖（葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、蜜三糖、阿拉伯糖），乙醇和甜菜堿。質(zhì)子信號(hào)的詳細(xì)歸屬見表1。

紫色代表實(shí)驗(yàn)峰形（Purple： experimental peak shape）； 綠色代表解卷積處理法的峰形（green： The peak shape of GSD processing）。

面積進(jìn)行比較，計(jì)算8種成分的含量。

3.3方法學(xué)考察結(jié)果

方法學(xué)考察結(jié)果見表2，普通峰提取積分定量核磁法的乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9763～0.9990，精密度RSD為1.6%～4.6%，穩(wěn)定性RSD為0.75%～8.6%，重復(fù)性RSD為0.94%～4.6%，加樣回收率的范圍為80.7%～98.1%。

綜合比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2和表3）顯示， 解卷積定量核磁法的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性總體優(yōu)于普通峰提取積分定量核磁法，尤其對(duì)質(zhì)子信號(hào)峰重疊度較高的脯氨酸和焦谷氨酸，以及端基質(zhì)子信號(hào)峰距水峰較近的葡萄糖和蔗糖的含量測(cè)定準(zhǔn)確度改善顯著。

3.4樣品測(cè)定

采用解卷積1HNMR定量分析法測(cè)定5個(gè)廠家20批次的黃芪注射液中8種初生代謝成分（乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸）的含量。結(jié)果參見表4。

3.5模式識(shí)別分析

5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品的NMR數(shù)據(jù)（每批n=3），采用主成分分析（Principal components analysis，PCA）法對(duì)60個(gè)樣品進(jìn)行無監(jiān)督的模式識(shí)別分析。PCA碎石圖顯示： 主成分PC1和PC2的累積解釋變量超過90%（圖3A）； 得分圖顯示： 5個(gè)廠家黃芪注射液樣品具有明顯的聚類和分組效果（圖3B）。圖4進(jìn)一步顯示： 乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分在5個(gè)廠家樣品中含量水平差異顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 8種初生代謝成分對(duì)區(qū)分不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品也具有重要作用。

4結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)子核磁共振指紋譜檢測(cè)并鑒定出黃芪注射液中24種成分，其中20種為初生代謝成分，根據(jù)黃芪注射液的工藝＼[10＼]推測(cè)其中的乙醇可能來源于藥材提取過程中使用的溶劑，而其他19種初生代謝成分均為黃芪藥材中的化學(xué)成分。分別采用普通峰提取和解卷積峰提取的定量核磁法，對(duì)乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸8種初生代謝成分的含量進(jìn)行分析，方法學(xué)考察結(jié)果顯示： 對(duì)于重疊度較高的質(zhì)子信號(hào)峰，以及巨大溶劑峰信號(hào)旁邊的樣品質(zhì)子信號(hào)峰，解卷積定量核磁法可有效改善其含量測(cè)試的準(zhǔn)確度。應(yīng)用該方法對(duì)5個(gè)廠家20批黃芪注射液樣品中8種初生成分進(jìn)行定量分析，結(jié)合PCA模式識(shí)別法成功區(qū)分了不同廠家的黃芪注射液產(chǎn)品。結(jié)果顯示： 正大青春寶藥業(yè)樣品中除焦谷氨酸外，其他都趨于中等水平； 大理藥業(yè)樣品中氨基酸、有機(jī)酸和糖類成分的濃度相對(duì)偏低； 上海新亞藥業(yè)樣品中蔗糖的濃度較低，其他氨基酸和有機(jī)酸成分較其他廠家高。上述研究提示： 除黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等指標(biāo)成分，氨基酸、有機(jī)酸、糖類等初生代謝成分受不同廠家藥材來源、生產(chǎn)工藝影響也較大，是區(qū)分不同廠家黃芪注射液產(chǎn)品的重要指標(biāo)。

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11CHEN YanYan， LI XiaoNan WANG YueFei， JIANG MiaoMiao. China Science Paper， 2014， 12（9）： 1410-1413

陳燕燕， 李曉男， 王躍飛， 姜苗苗. 中國科技論文， 2014， 12（9）： 1410-1413

AbstractTo establish the quantification method for 8 primary metabolites （amino acids， organic acids and carbohydrates） in Huangqi Injection， proton magnetic resonance （1H NMR） technique was employed based on processing approach of global spectral deconvolution （GSD）. About 10 mg of each sample was precisely weighed after freezedrying， and then directly dissolved in D2O for NMR analysis. 20 primary metabolites and 4 secondary metabolites were detected and identified in the same 1H NMR spectrum. Among them， 8 primary metabolites （acetate， proline， pyoglutamate， malonate， glycine， glucose， sucrose， formate） were selected to determine the contents using an internal standard method. In the given concentration ranges， it showed a good linear correlation for 8 components （R2>0.9990） ， with the RSD of precision lower than 3.8%， the RSD of repeatability lower than 2.7%， the RSD of stability lower than 4.5%， and the recovery rate between 91.40%-102.7%. The results indicated more accurately integral areas could be obtained by GSD processing compared to the ordinary method， which further improved the accuracy of content analysis. 1H NMR method based on GSD was successfully used to determine the levels of 8 primary metabolites in Huangqi Injection samples of 20 batches from 5 manufacturers. The score plots of PCA also showed the samples from different manufacturers clustered and classified well.

KeywordsProton magnetic resonance； Deconvolution； Huangqi Injection ； Primary metabolites

（Received 23 January 2015； accepted 7 April 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81303181）

第八屆科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽征集合作期刊邀請(qǐng)函

一、 科學(xué)儀器網(wǎng)絡(luò)原創(chuàng)作品大獎(jiǎng)賽簡(jiǎn)介（以下簡(jiǎn)稱“大賽”）

原創(chuàng)大賽以儀器信息網(wǎng)為平臺(tái)，倡導(dǎo)“鼓勵(lì)創(chuàng)新、積極分享、促進(jìn)交流”的理念，挖掘原創(chuàng)精品，促進(jìn)分析人員的技術(shù)交流，提高行業(yè)整體儀器應(yīng)用水平。

自2008年起，大賽已成功舉辦了七屆，參與人數(shù)近3000人，累計(jì)征集作品6600余篇，展現(xiàn)次數(shù)500萬次，合作期刊、媒體及展會(huì)100余家。深受業(yè)內(nèi)用戶的歡迎和支持，樹立了良好的品牌活動(dòng)形象。

二、本屆大賽時(shí)間：2015年7月1日～9月30日

三、本屆大賽網(wǎng)址：http：//www.instrument.com.cn/activity/2015yc/

四、大賽征稿對(duì)象和范圍

1、征稿對(duì)象

儀器使用者、分析測(cè)試從業(yè)人員、行業(yè)專家、廠商工程師等。儀器信息網(wǎng)注冊(cè)用戶即可參與（快速注冊(cè)地址： http：//bbs.instrument.com.cn/）。

2、征稿范圍

共設(shè)立色譜、質(zhì)譜、光譜及X射線、材料測(cè)試、食品檢測(cè)、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及采購、綜合類九個(gè)賽區(qū)。

五、征集作品類別：儀器維護(hù)維修、儀器使用經(jīng)驗(yàn)、圖譜解析、分析方法開發(fā)與應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)室管理方法與建設(shè)、儀器選型、采購交流等多方面。

六、2015年度大賽亮點(diǎn)

2015年將舉辦第八屆原創(chuàng)大賽，本屆大賽禮品總價(jià)值超過10萬元，是儀器論壇2015年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng)，儀器信息網(wǎng)將利用優(yōu)勢(shì)資源進(jìn)行全方位宣傳，征集原創(chuàng)作品近千篇，吸引百萬人次關(guān)注，將對(duì)行業(yè)產(chǎn)生廣泛和深遠(yuǎn)的影響力。

同時(shí)，大賽充分吸取往屆經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合大眾評(píng)審團(tuán)打分、網(wǎng)站和微信投票及專家打分三個(gè)方面選拔獲獎(jiǎng)作品。月度參賽作品將在擁有10萬粉絲的微信公眾平臺(tái)進(jìn)行投票；每個(gè)賽區(qū)邀請(qǐng)3位以上業(yè)內(nèi)知名專家進(jìn)行年度評(píng)審，并對(duì)參賽作品進(jìn)行點(diǎn)評(píng)。

七、期刊與本屆原創(chuàng)大賽

儀器論壇擁有超過200萬的科學(xué)儀器行業(yè)注冊(cè)會(huì)員，原創(chuàng)大賽作為儀器論壇年度最重要的網(wǎng)上活動(dòng)，擁有知名度高、宣傳度廣、影響力大的特點(diǎn)。

原創(chuàng)大賽希望與期刊合作，所有參賽作品在網(wǎng)上參賽的同時(shí)，可將論文格式的文章投稿合作期刊，并享受快速審稿的"綠色通道"，在1個(gè)月內(nèi)獲得錄用與否的通知。

與本屆原創(chuàng)大賽合作的期刊，可以在大賽頁面中設(shè)置獨(dú)立期刊介紹頁面。期刊可以通過大賽，收到大量投稿，此外，可以借助大賽平臺(tái)充分展現(xiàn)期刊特點(diǎn)，極大的提升期刊影響力。