海洋生物金屬硫蛋白開發(fā)利用研究進(jìn)展

朱曉瑩 孟霄 姚海洋 許星鴻

摘要：金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類普遍存在于生物體內(nèi)的富含半胱氨酸且可以結(jié)合金屬的特殊蛋白質(zhì)。就MT的理化性質(zhì)、生理功能以及開發(fā)利用進(jìn)行了總結(jié)，著重介紹了海洋生物MT的特點以及研究現(xiàn)狀，并對其今后的研究方向提出了展望。

關(guān)鍵詞：金屬硫蛋白；海洋生物；生理功能；開發(fā)利用

中圖分類號：Q178.53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）10-0009-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.002

Research Progress on the Development and Utilization of Metallothionein

of Marine Organism

ZHU Xiao-ying1，MENG Xiao1，YAO Hai-yang1，XU Xing-hong1，2

（1.College of Marine Science & Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；

2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

Abstract： Metallothionein（MT） is a class of proteins that are commonly found in organisms with small molecular weight， rich in cysteine， which can bind to metals and have multiple isomers. The research progress of MT was summarized， including the physical and chemical properties； The physiological function， the development and utilization of MT of the marine organism was mainly introduced. The prospects of the research field were also presented.

Key words： metallothionein； marine organism； physiologic function； development and utilization

美國學(xué)者M(jìn)ackay等[1]于1957年在馬的腎中首次發(fā)現(xiàn)并分離出了金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）），隨后在動物、植物和微生物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)含有MT，且不同物種組織器官中的MT所含氨基酸的數(shù)目及構(gòu)成不同[2]。目前關(guān)于MT的研究已涉及到農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、保健、生物工程、環(huán)境保護等多個領(lǐng)域。作者總結(jié)了MT的特性及目前開發(fā)利用的研究概況，著重分析了海洋生物MT的研究現(xiàn)狀，并對該領(lǐng)域的研究方向提出了展望。

1 MT的理化性質(zhì)

MT在生物進(jìn)化上高度保守，具有相對分子質(zhì)量低（6～7 kD）、富含半胱氨酸（25%～30%）、組氨酸含量少、缺乏芳香族氨基酸并能結(jié)合金屬離子等特性[3]。幾乎所有MT具有Cys-X-Cys（X為除Cys以外的其他氨基酸）特征序列，并存在多種異構(gòu)體，且分布于不同的生物及組織器官中[4]。MT的等電點一般在4左右，但不同種屬MT的等電點有差異。哺乳動物MT的等電點為3.9～4.6，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的水生生物MT的等電點為3.5～6.0。MT的存在形式及其穩(wěn)定性與其是否結(jié)合了金屬離子、結(jié)合的金屬種類以及所在環(huán)境的pH密切相關(guān)[5]。同樣，MT的光吸收特征除了與氨基酸組成有關(guān)外，也與它所結(jié)合的金屬種類密切相關(guān)。

2 MT的生理功能

2.1 清除體內(nèi)自由基和抗輻射作用

在生物體新陳代謝過程中，細(xì)胞的各項生命活動會不斷產(chǎn)生具有強氧化性的自由基，這會對機體造成氧化損傷；而MT可以清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)免疫功能和細(xì)胞代謝，從而提高機體的自我保護和修復(fù)能力，是已知的內(nèi)源性自由基清除劑中最強的一種[6]。研究表明，百草枯處理后的正常野生型小鼠（Mus musculus）的損傷程度顯著低于MT缺失小鼠，表明MT對機體具有保護作用[7]。高劑量Zn-MT可提高小鼠谷胱甘肽過氧化酶活力、降低肝臟過氧化脂質(zhì)和心肌脂褐質(zhì)含量，表明MT具有抗氧化及增強免疫力的作用[8]。研究表明，MT具有保護細(xì)胞免受輻射損傷的功能，在口服MT后進(jìn)行輻射處理的小鼠能夠延長存活時間[9]；用轉(zhuǎn)MT基因的平菇[Pleurotus ostreatus（Jacq.）P. Kumm.]飼喂小鼠后進(jìn)行輻射處理，結(jié)果小鼠的損傷程度較小[10]。

2.2 調(diào)節(jié)機體發(fā)育、增強應(yīng)激能力

在不同物種以及不同發(fā)育階段，MT含量存在較大差異，如大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠和家兔（Oryctolagus cuniculus f. domesticus Gmelin）等在胚胎期和剛出生時，肝臟中MT含量最高，而人和豚鼠（Cavia porcellus f.）等在懷孕中期或晚期最高[11]。MT含量在胎鼠、新生鼠的肝細(xì)胞核當(dāng)中較高，隨著發(fā)育核中MT含量逐漸降低，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，表明MT在細(xì)胞內(nèi)的定位也與發(fā)育過程有關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分化程度越小其核中MT的含量越高，其調(diào)控細(xì)胞分化主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中金屬離子而影響有關(guān)基因的表達(dá)[13]。有研究者認(rèn)為，細(xì)胞核中高含量的MT有保護細(xì)胞DNA和抑制細(xì)胞凋亡的作用[14]，當(dāng)機體的組織器官中MT基因表達(dá)水平下調(diào)或缺乏時，對細(xì)胞凋亡更敏感；同時，當(dāng)機體處于不良環(huán)境或者受到各種致病因子的侵害時，MT基因表達(dá)上調(diào)，表明MT具有增強機體應(yīng)激能力的作用。

2.3 重金屬的解毒功能

MT特殊的結(jié)構(gòu)序列（Cys-X-Cys）賦予了MT具有螯合金屬離子這一重要的功能[15]。MT基因敲除后的小鼠在重金屬脅迫下死亡率顯著高于正常小鼠，表明MT能夠削弱重金屬危害而對機體起到保護作用[16]。Cd處理后，果蠅（Droaophil melanogaster）MT基因表達(dá)上調(diào)、MT含量顯著升高，表明果蠅可通過體內(nèi)MT基因高表達(dá)保護機體免受損害[17]。中華稻蝗（Oxya chinensis Thunberg）在Cd脅迫下，MT基因的表達(dá)和Cd蓄積狀況均顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[18]。對水生動物MT的研究結(jié)果表明，機體內(nèi)重金屬的轉(zhuǎn)運和積累也與MT有關(guān)[19]。

2.4 MT與腫瘤

已有研究發(fā)現(xiàn)，MT參與腫瘤細(xì)胞的分化、增生及凋亡過程[20]。MT和其他一些腫瘤標(biāo)志物如P53、PCNA、VEGF等之間的聯(lián)系進(jìn)一步證明MT與細(xì)胞增生相關(guān)[21，22]。MT可保護細(xì)胞抵抗重金屬和烷化劑的致癌、致突變作用，可用于腫瘤臨床的輔助治療和腫瘤標(biāo)志物標(biāo)識[23]，這對腫瘤的臨床診斷與治療具有重要意義。于立博等[24]用不同濃度鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）MT提取液對人肺癌細(xì)胞株（A549）、人胃癌細(xì)胞株（MGC-803）、人乳腺癌細(xì)胞株（Bcap-37） 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察了腫瘤細(xì)胞的抑制率和凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制率和細(xì)胞凋亡率均增加，表明鷹嘴豆MT可抑制腫瘤細(xì)胞增長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3 海洋生物MT的研究現(xiàn)狀

近年來，隨著工業(yè)的高度發(fā)展，重金屬對海洋環(huán)境的污染日益嚴(yán)重，威脅著人類健康，因而海洋環(huán)境重金屬污染的防治問題越來越受到人們的關(guān)注。MT的重金屬解毒功能使得對海洋生物MT的研究亦逐漸增多。迄今國內(nèi)外對海洋生物MT的研究主要集中于海洋動物，而對海洋植物、微生物等的MT研究相對較少。

3.1 海洋動物

3.1.1 海洋脊椎動物 魚類是現(xiàn)存脊椎動物亞門中種類最多的生物類群，廣泛分布于全世界各個水域，絕大多數(shù)生活在海水中。隨著海洋水環(huán)境的污染，魚類MT基因作為生物標(biāo)志物已越來越多地應(yīng)用到水環(huán)境重金屬污染的監(jiān)測上。許氏平鲉（Sebastes schlegelii Hilgendorf）幼體在含不同濃度砷的水體中脅迫20 d后，其MT基因的表達(dá)顯著增加[25]。泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）在不同濃度Cd脅迫時，Cd濃度越高、脅迫時間越長，MT基因的相對表達(dá)水平越高[26]。目前報道多為針對重金屬單因素對魚類MT基因表達(dá)的影響研究[25-27]，而復(fù)合污染對魚類MT基因表達(dá)的影響以及重金屬脅迫下魚類MT基因表達(dá)有無種屬和性別差異等方面的文獻(xiàn)較少。陳春亮等[28]通過Hg、Cd單一和混合暴露試驗，分析了水體中Hg和Cd急性污染對紫紅笛鯛（Lutjanus sanguineus Cuvier）肝組織MT的脅迫效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一、混合暴露下皆有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系，但混合暴露濃度組的誘導(dǎo)率總體上低于單一暴露下的誘導(dǎo)率，說明Hg、Cd混合狀態(tài)下具有拮抗作用。Beg等[29]分別用重金屬脅迫黃鰭鯛（Acanthopagrus latus Houttuyn）和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）后發(fā)現(xiàn)，與半滑舌鰨相比，黃鰭鯛肝臟和鰓組織中的重金屬和MT濃度較高，表明MT基因的表達(dá)存在種屬差異。謝晴等[30]用Cd分別脅迫雄性和雌性黑點青鳉（Oryzias melastigma Mc Clelland）的試驗表明，在相同濃度Cd脅迫下，雄性黑點青鳉肝臟MT基因的表達(dá)比雌性更敏感。這是首次報道在重金屬脅迫下，魚類MT基因的表達(dá)具有性別差異。因此，利用生物標(biāo)志物監(jiān)測水環(huán)境重金屬污染狀況時，還應(yīng)當(dāng)考慮動物的性別差異。

3.1.2 海洋無脊椎動物 對海洋無脊椎動物MT的研究多為分析不同組織中MT基因的分子特征及金屬離子蓄積狀況。哺乳動物的MT通常有61個氨基酸，同源性較高，而海洋無脊椎動物MT序列含有約70個氨基酸，同源性較低。如馬氏珠母貝（Pinctada martensii Dunker）MT基因cDNA序列全長為512 bp，開放閱讀框為237 bp，編碼78個氨基酸[31]。從三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus Miers）精巢中也克隆到了MT基因的cDNA序列，其中MT-1全長為450 bp，編碼58個氨基酸，含有19個半胱氨酸；MT-2全長581 bp，編碼59個氨基酸，含有18個半胱氨酸，MT-1和MT-2與無脊椎動物（尤其是蟹類）的MT同系物更相似[32]。因此，海洋無脊椎動物的MT隨物種不同有較大差異，其進(jìn)化可能是一個趨同進(jìn)化過程，即越高等的動物其MT越趨向于穩(wěn)定。

大量研究表明，海洋無脊椎動物MT的表達(dá)以及組織內(nèi)重金屬蓄積具有組織和種屬特異性，且組織中MT與重金屬有劑量依賴性[33]。蔣國萍等[34]在斧文蛤（Meretrix lamarchii Deshayes）5種組織中均檢測到有MT表達(dá)，且存在組織特異性；在相同金屬離子濃度脅迫下，近江牡蠣（Ostrea rivularis Gould）對Cd的富集能力大于Pb[35]；幼年刺參（Stichopus japonicus Selenka）在Cd脅迫36 h后，其各組織間MT含量有顯著差異[36]。在測定巴伊亞布蘭卡河口沉積物中的重金屬含量時，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)雄蟹體內(nèi)MT含量比雌蟹高[37]。Angela等[38]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下，牡蠣（Saccostrea sp.）消化腺中MT含量顯著升高，而卵母細(xì)胞中卵黃蛋白原含量明顯下降，推測MT和卵黃蛋白原2種蛋白質(zhì)表達(dá)在Cd脅迫下存在一定的交互作用。

3.2 海洋植物

目前對海洋植物MT的研究多集中于藻類。Naoto等[39]報道，小球藻（Chlorella sorokiniana L.）MT可被Cd誘導(dǎo)，并對其進(jìn)行了分離純化。Morris等[40]亦從墨角藻（Fucus vesiculosus L.）分離出了MT。實驗室內(nèi)重金屬培養(yǎng)和養(yǎng)殖區(qū)培育的海帶（Laminaria japonica Arsch）隨時間和濃度變化對Cu、Zn和Cd呈現(xiàn)不同程度的富集能力，MT在Cu和Cd單因素誘導(dǎo)下呈現(xiàn)遞減趨勢，而Zn誘導(dǎo)后呈現(xiàn)遞增趨勢，在多元素誘導(dǎo)下呈現(xiàn)遞減趨勢[41]。用不同濃度的鋅鹽對處在對數(shù)生長期的小球藻分別脅迫培養(yǎng)后，鋅離子濃度為5 μmol/L時，對小球藻生長產(chǎn)生顯著抑制，且抑制程度隨鋅離子濃度的增加而增大；鋅離子濃度為50 μmol/L時，誘導(dǎo)產(chǎn)生的鋅結(jié)合MT量達(dá)到最高[42]。

3.3 海洋微生物

近年來，隨著核工業(yè)的迅速發(fā)展，對含鈾廢水的回收處理已成為新的研究熱點，有研究表明，微生物對鈾離子具有很強的吸附作用[43]。李敏[44]研究發(fā)現(xiàn)，克隆有MT基因的工程菌細(xì)胞對鈾離子的吸附量顯著高于野生型菌株細(xì)胞，且其吸附速度更快、吸附量更大。秦配玲[45]報道，轉(zhuǎn)MT組成型表達(dá)絮凝酵母SPSCO1pcr對Cr的還原速率比出發(fā)菌株SPSCO1提高40%，SPSCOlpcr對總Cr、Cu和Cd的去除率分別為61.13%、75.73%和57.28%，均高于出發(fā)菌株SPSCO1和轉(zhuǎn)MT誘導(dǎo)型表達(dá)絮凝酵母SPSCO1pr的去除率。

4 MT的開發(fā)利用

4.1 MT在海洋環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

MT分布廣泛且具有重金屬解毒功能，可作為生物標(biāo)志物用來監(jiān)測海洋水體環(huán)境重金屬的污染程度。而隨著對MT研究的深入，發(fā)現(xiàn)在重金屬脅迫下，海洋生物體內(nèi)MT基因的表達(dá)量不僅與所處環(huán)境中重金屬的含量有關(guān)，還受其他環(huán)境因素（金屬離子、溫度、O2、pH等）的影響[46，47]。因此，今后的研究應(yīng)充分考慮其他環(huán)境因素與MT表達(dá)量的關(guān)系，這將有望提高M(jìn)T的重金屬解毒能力以及作為生物標(biāo)志物來檢測海洋環(huán)境污染的精確度，對于海洋生態(tài)環(huán)境保護具有重要意義。

4.2 MT在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)臨床研究表明，MT與腫瘤、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病密切相關(guān)[48，49]。雖然各種疾病發(fā)生的原因十分復(fù)雜，但其誘發(fā)的重要原因之一是脂質(zhì)過氧化水平過高；而MT可以清除體內(nèi)自由基，降低機體的脂質(zhì)過氧化水平，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、增強機體免疫能力和抗輻射損傷等，對疾病的輔助治療具有較好的效果[50]。另外在某些微量元素缺乏癥、口腔潰瘍、胃潰瘍，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗炎、抗感染等方面MT也能發(fā)揮積極作用[51]。

4.3 MT在保健食品行業(yè)中的應(yīng)用

隨著人們保健意識的逐漸提高，市場對營養(yǎng)保健品的需求量越來越大。天然活性物質(zhì)MT除了可以制成藥物制劑外，還可添加于功能食品或直接制成可食用的產(chǎn)品，如具有抗衰老、抗輻射、降血脂以及護膚美容等功效的片劑和功能飲料能降低氧化損傷程度、促進(jìn)血液循環(huán)、補充微量元素和增強免疫能力，可以延緩衰老和預(yù)防各種疾病的發(fā)生[52，53]。

4.4 MT在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著時代的發(fā)展，形形色色的化妝品大量涌現(xiàn)于市場，其中人們最熟悉的就是含有超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化成分的化妝品。有關(guān)研究表明，MT也具有抗氧化等多種功效，且與SOD相比具有清除自由基、抗氧化和抗輻射能力強、半衰期長、熱穩(wěn)定性高、分子量小、易被機體吸收等優(yōu)點，而且MT是內(nèi)源性蛋白，安全性能好，在機體中有著不可替代的作用[54]，因而可以作為化妝品添加劑應(yīng)用，起到抗衰老、抗輻射、清除色素、抗感染等作用，同時也可替代化學(xué)性化妝品，以減輕對人體造成的毒害作用[55]。

5 展望

MT作為具有結(jié)合金屬功能的天然活性物質(zhì)，有望在環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、保健、化妝品以及生物化工等領(lǐng)域進(jìn)行開發(fā)利用。目前，對于不同海洋生物MT的分子結(jié)構(gòu)及功能、基因克隆與表達(dá)等方面的研究日益深入，但其作用機制尚不明晰，有待進(jìn)一步確認(rèn)，并且海洋生物MT各異構(gòu)體的具體功能及其存在差異的原因有待闡明。海洋生物MT具有種屬和組織特異性，因此要選擇合適的物種和組織器官進(jìn)行海洋環(huán)境監(jiān)測與風(fēng)險評估，并且要建立和完善快速靈敏、特異性強的檢測方法。在研究重金屬對海洋生物于分子水平上的作用機制時，要考慮多種重金屬復(fù)合作用以及環(huán)境因子對海洋生物組織器官蓄積重金屬、解毒機制和解毒途徑的影響，為進(jìn)一步研發(fā)高效、無污染的重金屬解毒劑、治理海洋水體污染以及提高食品安全奠定理論基礎(chǔ)。以海洋藻類MT為標(biāo)志物來指示海洋環(huán)境中重金屬污染狀況以及對重金屬造成的海洋水體污染的修復(fù)具有較大的潛力，可利用基因工程技術(shù)，將MT固定于微生物里，開發(fā)新型、高效的生物吸附材料，這將為廢水的處理回收、減少環(huán)境污染提供有效的技術(shù)手段。在MT可作為生物藥物成分而制成各種劑型的治療藥物推廣應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)方面，亦可作為既能補充營養(yǎng)、又具調(diào)節(jié)功能的新型保健食品以及化妝品添加劑，這也具有廣闊的應(yīng)用前景。

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