植物乳桿菌發(fā)酵液對冷藏雙孢蘑菇生理生化性質(zhì)的影響

高帥平，李順峰,*，李 靜，王安建

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培最廣、產(chǎn)量最大的食用菌[1]。雙孢蘑菇富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、多酚和黃酮等營養(yǎng)活性物質(zhì)，具有較好的營養(yǎng)作用和保健功能，且味道鮮美，深受消費者喜愛[2-3]。然而雙孢蘑菇菇蓋表面無保護(hù)結(jié)構(gòu)，且含水量高，呼吸旺盛，極易發(fā)生褐變、衰老、失水、微生物侵染等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，常溫下其貨架期不超過3 d[4-5]。研究表明，酶促褐變和活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化損傷是影響雙孢蘑菇采后品質(zhì)的重要因素[5-6]。低溫冷藏、氣調(diào)貯藏、射線輻射處理和化學(xué)保鮮是保持雙孢菇品質(zhì)的主要方法，但卻存在著保鮮效果差、成本高及安全性低等問題[7-10]。隨著社會發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，對食品安全和品質(zhì)要求越來越高，尋找安全環(huán)保的保鮮劑受到廣泛關(guān)注。

植物乳桿菌（Latobacillus plantarum）是乳酸菌的一種，與其他種類其他乳酸菌相比，該菌的活菌數(shù)較高，除能產(chǎn)生大量調(diào)節(jié)pH值和降解重金屬的有機(jī)酸，還能產(chǎn)生細(xì)菌素、H2O2、雙乙酰等抗菌物質(zhì)，可作為生物防腐劑抑制病原微生物的生長[11-14]。目前，植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物多應(yīng)用在肉制品、水產(chǎn)品、奶制品以及發(fā)酵制品等食品工業(yè)中，而在新鮮果蔬貯藏保鮮方面的研究較少。Martínez-Castellanos等[15]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能夠降低荔枝果皮的微生物含量，同時保持花色苷含量和降低果皮褐變程度。植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸能夠酸化紅毛丹果實的果皮和抑制褐變，植物乳桿菌處理還能保持其果皮的色澤和降低水分的損失[16]。這說明植物乳桿菌不僅能減輕果蔬的褐變與腐爛，還能保持果蔬的營養(yǎng)品質(zhì)和減少水分的損失。

本實驗通過研究植物乳桿菌發(fā)酵液處理對雙孢蘑菇冷藏過程中顏色、總酚含量、褐變相關(guān)酶活力、ROS含量及抗氧化酶活力等方面的影響，揭示植物乳桿菌對雙孢蘑菇的保鮮作用及機(jī)理，進(jìn)而為開發(fā)新型、綠色雙孢蘑菇保鮮劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）采自洛陽奧達(dá)特食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司，采收后分層放入貯運保鮮箱預(yù)冷后立即運回實驗室進(jìn)行處理，選取大小和成熟度一致、顏色潔白、無開傘、無病蟲害和機(jī)械損傷的雙孢蘑菇進(jìn)行實驗。

植物乳桿菌（Latobacillus plantarum）GIM1.191廣東省微生物菌種保藏中心；所有檢測用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Color Flex EZ色差儀 美國Hunterlab公司；TMSPro質(zhì)構(gòu)儀 美國Food Technology公司；LHS-250HC-Ⅱ恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Revco ExF24086V超低溫冰箱 美國Thermo公司；FA2004C分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV1800紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

常溫（20±1）℃條件下，將雙孢蘑菇在體積分?jǐn)?shù)2%植物乳桿菌接種發(fā)酵液（37 ℃培養(yǎng)16 h）10 倍稀釋液中浸泡處理5 min，取出后瀝干水分，放置于塑料筐內(nèi)且表面用聚乙烯保鮮膜（氧氣透過率（14 200.00±0.40）cm3/（m2·d·atm）、二氧化碳透過率（65 000.00±0.20）cm3/（m2·d·atm）、透濕量（68.00±0.20）g/（m2·d））包裹后在4 ℃、相對濕度85%條件下貯藏，以清水處理的雙孢蘑菇為對照。每隔3 d取樣1 次，進(jìn)行顏色評價后，用液氮將鮮樣凍干粉碎后貯藏于—80 ℃冰箱備用。

1.3.2 色澤評價

用ColorFlex EZ色差儀測定雙孢蘑菇菇蓋的CIE L*（白/黑）值，儀器用標(biāo)準(zhǔn)白板（L*＝94.11）校正，每個處理組測定10 個整菇，用L*值表示顏色變化，L*值越高表示褐變程度越輕，品質(zhì)越好。

1.3.3 總酚含量的測定

總酚含量采用福林-酚法測定，用沒食子酸當(dāng)量（mg/g）表示，結(jié)果以鮮質(zhì)量計[2]。

1.3.4 PPO、PAL活力的測定

取雙孢蘑菇凍干粉1.0 g，加入50 mmol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液（含0.8 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和1 mmol/L EDTA）5 mL，冰浴提取10 min，10 000 r/min離心15 min（4 ℃），上清液即為粗酶液，參照Gao Mengsha等[2]的方法測定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）的活力，以1 min內(nèi)OD值減少0.01所需的酶量為一個酶活力單位（U），酶活力以U/mg pro表示。蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[17]，以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 H2O2含量、抗O2-·活力的測定

取雙孢蘑菇凍干粉1.0 g，加入預(yù)冷的丙酮，冰浴提取10 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為樣品提取液[18]。H2O2含量、抗·活力采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.6 POD、CAT活力的測定

取雙孢蘑菇凍干粉樣品1.0 g，加入50 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液5 mL，冰浴提取10 min，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，參照Aebi[19]的方法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活力。蛋白質(zhì)含量的測定同1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇顏色的影響

顏色是評價雙孢蘑菇的重要指標(biāo)之一，也是影響消費者對雙孢蘑菇接受程度的關(guān)鍵因素[20]。本實驗采用L*值來反映雙孢蘑菇顏色的變化，L*值越大，表示其表面亮度越高，褐變程度越低，品質(zhì)越好[21]。如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，L*值先逐漸下降之后出現(xiàn)平穩(wěn)波動；在貯藏前期（0～6 d），對照組的L*值迅速下降，而處理組下降較緩慢；在整個貯藏過程中，處理組的L*值均高于對照組。表明植物乳桿菌發(fā)酵液處理可以減輕雙孢蘑菇的褐變程度，保持較好的顏色。

圖 1 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇L*值的影響Fig. 1 Effect of Latobacillus plantarum-fermented liquid on L* value of Agaricus bisporus

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇總酚含量的影響

酚類物質(zhì)是雙孢蘑菇發(fā)生酶促褐變的重要底物[22]。當(dāng)菇體受到傷害或自然老化時，在PPO的作用下，酚類物質(zhì)被催化氧化為醌類物質(zhì)，并進(jìn)一步聚合形成粉色、褐色化合物，導(dǎo)致菇體褐變，從而影響其商品價值[7,23]。如圖2所示，對照組雙孢蘑菇的總酚含量在貯藏前期和貯藏后期均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，并分別于6 d和12 d出現(xiàn)大小峰值；與對照組相比，植物乳桿菌發(fā)酵液處理的雙孢蘑菇總酚含量均低于對照組，且在6 d時，其總酚含量為0.730 mg/g，比對照組低29.47%。表明植物乳桿菌發(fā)酵液處理可以有效減輕雙孢蘑菇內(nèi)總酚含量的積累，防止其褐變程度不斷加深。

圖 2 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇總酚含量的影響Fig. 2 Effect of the fermentation broth on total phenol content of Agaricus bisporus

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇PPO、PAL活力的影響

雙孢蘑菇組織中的PPO催化酚類物質(zhì)氧化為醌，進(jìn)而產(chǎn)生黑色素，是雙孢蘑菇貯藏過程中發(fā)生褐變的主要原因[23]。如圖3a所示，對照組雙孢蘑菇體內(nèi)的PPO活力在貯藏前期保持穩(wěn)定，之后逐漸升高，6 d時達(dá)到最大值后再緩慢下降；植物乳桿菌發(fā)酵液處理的雙孢菇PPO活力在整個貯藏期間內(nèi)顯著低于對照組（P＜0.05），貯藏6 d時的PPO活力為8.85 U/mg pro，比對照組低36.33%。表明植物乳桿菌處理可以有效降低雙孢蘑菇組織中的PPO活力，抑制褐變的產(chǎn)生。

圖 3 植物乳桿菌發(fā)酵液處理對雙孢蘑菇PPO（a）、PAL（b）活力的影響Fig. 3 Effect of the fermentation broth on PPO (a) and PAL (b)activities of Agaricus biaporus

PAL是次生代謝關(guān)鍵酶，對果蔬采后保鮮有著重要影響。有研究表明，當(dāng)植物受到病原菌侵染后，PAL活力被激發(fā)，迅速生成與抗病有關(guān)的植物保衛(wèi)素、生物堿等生化物質(zhì)，進(jìn)而有效抑制病原菌的擴(kuò)展，因此PAL活力可作為植物抗病性的重要指標(biāo)[24]。由圖3b可知，對照組雙孢蘑菇PAL活力在貯藏期間呈先上升后下降趨勢，在9 d時達(dá)到最大值。植物乳桿菌處理的雙孢蘑菇PAL活力在貯藏前期與對照組無顯著差異（P＞0.05），貯藏6 d后，其活力均高于對照組，貯藏9 d時PAL活力為0.21 U/mg pro，顯著高于對照組19%（P＜0.05）。這表明，植物乳桿菌處理可以提高貯藏后期PAL活力，從而增強(qiáng)雙孢蘑菇的抗病性。

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇H2O2含量和抗·活力的影響

ROS被認(rèn)為是果蔬采后代謝過程中的毒副產(chǎn)品，能引起大分子物質(zhì)如脂類、蛋白質(zhì)及DNA的損傷[25]。H2O2和·均是重要的ROS，其含量越高，對組織細(xì)胞的毒害作用越大。由圖4a可知，對照組雙孢蘑菇體內(nèi)的H2O2含量先緩慢上升然后保持基本穩(wěn)定，之后迅速上升，在12 d時達(dá)到最大值，然后下降至貯藏結(jié)束。在整個貯藏期內(nèi)，植物乳桿菌發(fā)酵液處理組雙孢蘑菇體內(nèi)的H2O2含量均低于對照組，并在3 d和12 d時呈顯著差異（P＜0.05）?？埂せ盍Ρ硎緳C(jī)體抑制·的能力，從圖4b可以看出，貯藏前期（0～6 d），對照組雙孢蘑菇抗·活力先略微升高再逐漸下降，貯藏后期，其呈先上升后下降的趨勢，并在12 d時達(dá)到最大值。在整個貯藏期內(nèi)，除了6 d時，兩組雙孢蘑菇抗·活力保持一致外，其他貯藏時間的植物乳桿菌發(fā)酵液處理組雙孢蘑菇抗·活力均高于對照組，且在貯藏后期（9～12 d）呈顯著差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵液處理可以降低雙孢蘑菇H2O2含量，同時提高其抗·活力，從而減輕ROS對雙孢蘑菇的毒害作用。

圖 4 植物乳桿菌發(fā)酵液處理對雙孢蘑菇H2O2含量（a）和抗·活力（b）的影響Fig. 4 Effect of the fermentation broth on H2O2 content (a) and antisuperoxide anion radical activity (b) of Agaricus biaporus

2.5 植物乳桿菌發(fā)酵液對雙孢蘑菇POD、CAT活力的影響

圖 5 植物乳桿菌發(fā)酵液處理對雙孢蘑菇POD（a）、CAT（b）活力的影響Fig. 5 Effect of the fermentation broth on POD (a) and CAT (b)activities of Agaricus biaporus

POD與植物組織抗性有關(guān)，其活力越高，抗逆作用越強(qiáng)；CAT是清除果蔬組織內(nèi)部H2O2的主要酶類，對組織細(xì)胞具有保護(hù)作用[26]。以上兩種酶均屬于抗氧化系統(tǒng)酶類。由圖5a可知，雙孢蘑菇POD活力隨著貯藏時間的延長，呈現(xiàn)先上升后下降再保持穩(wěn)定的趨勢，整個貯藏期內(nèi)，植物乳桿菌發(fā)酵液處理組雙孢蘑菇POD活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。雙孢蘑菇CAT活力如圖5b所示，貯藏前期（0～3 d），對照組CAT活力顯著下降，而處理組則略微上升；隨著貯藏時間的延長，對照組和植物乳桿菌發(fā)酵液處理組雙孢蘑菇CAT活力均呈先上升后下降趨勢，分別于9 d和6 d達(dá)到最大值；貯藏后期（12～15 d），兩組雙孢蘑菇CAT活力均緩慢上升。在整個貯藏期內(nèi)，植物乳桿菌發(fā)酵液處理組雙孢蘑菇CAT活力均顯著高于對照組（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，植物乳桿菌發(fā)酵液處理顯著提高了雙孢蘑菇POD和CAT活力（P＜0.05），增強(qiáng)了其抗氧化能力。

3 討 論

組織褐變是影響雙孢蘑菇品質(zhì)的重要因素，菇蓋在貯運過程中極易被擦傷，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而產(chǎn)生PPO催化酚類底物引起的酶促褐變和微生物侵染引起的病理褐變，最終導(dǎo)致菌蓋表面顏色加深[7,22-23]。因此，控制褐變的主要措施是抑制酶的活力、降低底物濃度和提高組織抗病性。本研究采用植物乳桿菌發(fā)酵液將雙孢蘑菇浸泡處理5 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵液處理降低了PPO活力，并提高了貯藏后期的PAL活力，這一結(jié)果與劉吟[27]、王相友[28]等發(fā)現(xiàn)采用穩(wěn)定態(tài)ClO2和可食性涂膜處理雙孢蘑菇可降低PPO活力，從而抑制褐變的結(jié)果相一致；而PAL活力升高可能與抗病性有關(guān)，王淑霞等[29]研究表明，當(dāng)植物受到病原菌侵染后，PAL活力被激發(fā)，迅速生成與抗病有關(guān)的植物保衛(wèi)素、生物堿等生化物質(zhì)，進(jìn)而有效抑制病原菌的擴(kuò)展[30]。

ROS迸發(fā)是機(jī)體衰老過程的重要事件，其能引起蛋白質(zhì)損傷、膜脂過氧化、DNA突變等不可逆損傷，導(dǎo)致機(jī)體衰老，H2O2和·均是重要的ROS種類[25]。而POD和CAT作為抗氧化酶在清除自由基和ROS中起著重要作用。POD是一種以鐵卟啉為輔基的酶類，在供電子體充足的條件下，可將低濃度的H2O2高效催化分解為H2O和O2[26]。CAT是一種含血紅素的4聚體酶，其作用亦是在·分解為H2O2后，將H2O2催化分解，從而最大限度減少羥自由基的生成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2含量和抗O2-·活力在貯藏后期顯著升高，CAT活力與H2O2含量呈負(fù)相關(guān)，表明ROS參與了雙孢蘑菇的成熟衰老，而CAT活力可能受到H2O2調(diào)控；植物乳桿菌發(fā)酵液處理能有效降低H2O2含量、增強(qiáng)抗·活力和提高POD、CAT活力，表明植物乳桿菌發(fā)酵液通過抑制ROS積累、提高抗氧化酶活力延緩了雙孢蘑菇的成熟衰老進(jìn)程，從而較好地保持了雙孢蘑菇品質(zhì)。

4 結(jié) 論

雙孢蘑菇在貯藏過程中會發(fā)生褐變，從而降低商品價值，而植物乳桿菌發(fā)酵液處理可以保持雙孢蘑菇的色澤，抑制PPO活力并提高貯藏后期PAL活力，降低褐變程度。

與對照組相比，植物乳桿菌發(fā)酵液處理能有效降低H2O2含量、增強(qiáng)抗O2-·活力和提高POD、CAT活力，通過抑制ROS積累、提高抗氧化酶活力延緩了雙孢蘑菇的成熟衰老進(jìn)程，從而較好地保持雙孢蘑菇品質(zhì)。