小麥醇溶蛋白糖基化改性過程中有害產(chǎn)物形成的影響因素分析

李 普，劉貴梅，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

目前世界小麥產(chǎn)量為每年6億 t左右，而我國是小麥生產(chǎn)大國，隨著小麥畝產(chǎn)量和種植面積的增加，小麥總產(chǎn)量逐年增加。小麥谷朊蛋白是小麥加工淀粉的副產(chǎn)物，最早由意大利科學(xué)家Beccari從小麥粉中洗出來[1]。醇溶蛋白占小麥谷朊蛋白的40%～50%[2]，主要為面團(tuán)提供黏性和延展性，這一特性使其可用作食用膜[3]或作為添加劑加入面包中提高面包的品質(zhì)[4]。由于小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)中非極性氨基酸組分較多，使得其在水中的溶解性很小[5]，限制了在食品中的應(yīng)用。為了進(jìn)一步拓展小麥谷朊蛋白的應(yīng)用范圍，國內(nèi)外研究學(xué)者通常通過改性的方法提高植物蛋白的功能特性。糖基化改性以其安全性高、改性效果顯著的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。

當(dāng)前用于糖基化改性的糖有：多糖（如葡聚糖、淀粉等）、雙糖（如麥芽糖等）、單糖（如葡萄糖、果糖等）。牛麗亞等[6]用葡聚糖作糖基供體，通過糖基化反應(yīng)對(duì)小麥胚芽蛋白改性，其溶解性得到改善；孔繁惠等[7]用葡萄糖、D-麥芽糖、β-環(huán)糊精作糖基供體對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行糖基化改性，同樣玉米醇溶蛋白的接枝度和溶解性得到明顯改善；王成波[8]用葡萄糖對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行糖基化改性，其溶解性、乳化性和起泡性以及泡沫穩(wěn)定性均得到一定程度的改善。

目前諸多研究表明糖基化改性行之有效，且對(duì)蛋白質(zhì)的功能活性有很大的提高，然而，蛋白質(zhì)與糖改性過程中，由于發(fā)生美拉德反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生一系列的有害中間產(chǎn)物（如甲基乙二醛（methyl glyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO））和終產(chǎn)物（晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs））。GO可以引起DNA病變[9]，會(huì)抑制細(xì)胞中DNA的合成，引起線粒體功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[10]；MGO通過產(chǎn)生凋亡物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和增殖的生長因子改變[11]，且能抑制蛋白質(zhì)、DNA、RNA在絨毛細(xì)胞、隱窩細(xì)胞和結(jié)腸細(xì)胞中的形成[12]。AGEs可以與膠原蛋白和晶狀體蛋白等組織蛋白結(jié)合，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，引起一系列病變[13]，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[14]，引起白內(nèi)障和視網(wǎng)膜病[15-16]，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)老化或者與老化有關(guān)的疾病[17]，加速生物個(gè)體衰老[18]等。目前國內(nèi)外對(duì)糖基化改性過程中有害產(chǎn)物的檢測(cè)及控制鮮見報(bào)道。大量研究表明，黃酮、酚酸等天然產(chǎn)物可以減少或抑制糖基化過程中有害產(chǎn)物的形成。Wu等[19]研究表明木犀草素、蘆丁、（-）-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、槲皮素對(duì)MGO誘導(dǎo)產(chǎn)生的AGEs有明顯的抑制作用；Sang Shengmin等[20]研究了EGCG、根皮素、根皮苷[21]、染料木素[22]對(duì)等MGO的抑制機(jī)理，發(fā)現(xiàn)這4 種物質(zhì)均能捕獲MGO形成加合產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制AGEs的產(chǎn)生。以上報(bào)道均在模擬生理?xiàng)l件下研究其抑制活性；但是，在食品加工或改性條件下的抑制功效尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究以醇溶蛋白為對(duì)象，采用氣相色譜法（測(cè)定MGO和GO含量）和熒光光譜法（λex/λem＝340 nm/465 nm，測(cè)定AGEs含量）探究不同因素（糖種類、葡聚糖質(zhì)量濃度和改性溫度、時(shí)間）對(duì)糖基化改性過程中有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs產(chǎn)生的影響，在醇溶蛋白改性體系中，選擇兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和半胱氨酸（cysteine，Cys）等天然產(chǎn)物，篩分有效抑制劑；并考察了添加抑制劑對(duì)改性蛋白乳化性的影響。以期為小麥蛋白糖基化改性的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的理論支持和安全保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥醇溶蛋白由南京師范大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自制；MGO（40%水溶液）、GO（40%水溶液）、衍生化試劑鄰苯二胺、槲皮素 美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（分析純） 南京化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）、葡萄糖、Cys、GSH、2,3-丁二酮均為分析純 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兒茶素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、木樨草素 南京廣潤生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7820氣相色譜系統(tǒng)（柱溫箱、H P-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、FID檢測(cè)器） 美國安捷倫公司；Infinite 200Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan有限公司；QL-861微型漩渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計(jì) 上海三信儀表廠；UV1600紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；T18高速勻漿機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 醇溶蛋白的制備與蛋白含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]方法，稱取小麥谷朊粉100 g，加入10 倍體積的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，磁力攪拌提取2 h后，10 000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液用去離子水透析（透析袋截留分子質(zhì)量12～14 kDa）24 h后，改用體積分?jǐn)?shù)0.1%的醋酸溶液透析24 h，溶出小分子的谷蛋白，再用去離子水透析24 h至中性，冷凍干燥，得到醇溶蛋白。

采用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：用0.05 mol/L的NaOH溶液配制質(zhì)量濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液；2）雙縮脲試劑的配制：取1.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500 mL蒸餾水中，在攪拌下加入300 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH溶液，用水稀釋至1 000 mL；3）取1 mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液于不同的試管中，每個(gè)試管中分別加入4 mL雙縮脲試劑，37 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，用可見光分光光度計(jì)測(cè)定其在540 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的醇溶蛋白溶液測(cè)定其吸光度，同上操作測(cè)定醇溶蛋白含量。

1.3.2 氣相色譜法檢測(cè)MGO/GO的含量

以2,3-丁二酮為內(nèi)標(biāo)，鄰苯二胺為衍生化試劑，采用共衍生化方法（參照前期研究建立的方法[24]）測(cè)定體系中MGO/GO的含量。

1.3.3 熒光分光光度法檢測(cè)樣品中AGEs的含量

取樣品1 mL，15 000 r/min離心20 min，取0.3 mL上清液測(cè)定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對(duì)熒光值，所有試樣均做3 組平行。

1.3.4 影響醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs形成的因素分析

1.3.4.1 糖種類的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別溶解醇溶蛋白和糖類。在8 支10 mL樣品管中各加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液，并分別加入1 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的麥芽糊精、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和阿拉伯糖溶液，加入PBS至6 mL。每組樣品在100 ℃水浴中加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應(yīng)。然后以8 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，并于-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一種糖做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法檢測(cè)MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.2 葡聚糖質(zhì)量濃度的影響

在4 支10 mL樣品管中各加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液，分別加入0.5、1.0、2.0、4.0 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。同1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)步驟測(cè)定樣品中檢測(cè)MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.3 改性反應(yīng)溫度的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。取4 支10 mL樣品管各加入2 mL質(zhì)量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液、1 mL質(zhì)量濃度為12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。在80、90、100 ℃沸水浴，110 ℃油浴下加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應(yīng)。然后以8 000 r/min離心30 min后，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一溫度做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法檢測(cè)MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.4 改性反應(yīng)時(shí)間的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。在7 支10 mL樣品管中各加入2 mL 6 mg/mL的醇溶蛋白溶液、1 mL 12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。在100 ℃沸水浴中分別加熱0、5、10、20、30、60、120 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應(yīng)。然后以8 000 r/min離心30 min后，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一溫度做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法檢測(cè)MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.5 改性條件下MGO/GO和AGEs天然抑制劑的篩選

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。在40 支10 mL樣品管中各加入2 mL 6 mg/mL醇蛋白、1 mL 12 mg/mL葡聚糖溶液和10 種不同體積（0.05、0.10、0.50、1.00 mL）抑制劑，包括6 mmol/L兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素甲醇溶液，6 mg/mL GSH、Cys PBS（0.05 mol/L、pH 11.0）溶液，再加入PBS至6 mL。樣品在100 ℃水浴中加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應(yīng)。然后以8 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，并于-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一種糖做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法檢測(cè)MGO/GO和AGEs含量。

1.3.5 抑制劑對(duì)改性醇溶蛋白乳化性能的影響

1.3.5.1 樣品制備

根據(jù)1.3.4.5節(jié)的結(jié)果，選擇濃度為0.5 mmol/L的染料木素、蘆丁和質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的Cys、GSH作為抑制劑。同1.3.4節(jié)方法，100 ℃沸水浴中加熱30 min進(jìn)行蛋白改性，分別制備添加和不添加抑制劑的改性醇溶蛋白，將所得蛋白樣品冷凍干燥。

1.3.5.2 乳化性測(cè)定

分別取原醇溶蛋白、改性醇溶蛋白、添加抑制劑的改性蛋白樣品于0.1 mol/L、pH 7.0的PBS中，使得蛋白終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，將6 mL樣品溶液和2 mL大豆油放入離心管中，高速勻漿1 min，立即從勻漿液底部吸取50 μL，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中，混勻后在500 nm波長處測(cè)定吸光度A0，代入下式計(jì)算乳化活性，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基硫酸鈉溶液作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為光徑（1 cm）；θ為大豆油質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.25%）；100為稀釋倍數(shù)；A0為乳狀液在0 min時(shí)的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇溶蛋白含量

用雙縮脲法測(cè)定的牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度（橫坐標(biāo)）與各質(zhì)量濃度蛋白在540 nm波長處的吸光度（縱坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y＝0.047 8x+0.009 2（R2＝0.998 3）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定制備所得的醇溶蛋白含量為95%。

2.2 MGO和GO含量

以MGO質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，MGO與內(nèi)標(biāo)峰的面積之比為縱坐標(biāo)，MGO的質(zhì)量濃度在0～20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。測(cè)得MGO的線性回歸方程為：y＝0.063 7x+0.010 6（R2＝0.999 2）。以GO質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，GO與內(nèi)標(biāo)峰的面積之比為縱坐標(biāo)，GO的質(zhì)量濃度在0～20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。測(cè)得GO的線性回歸方程為：y＝0.062 5x+0.002（R2＝0.999 3）。

2.3 糖種類對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 1 糖種類對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 1 Effect of sugar type on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

目前用于蛋白糖基化改性的既有單糖也有多糖。為了研究不同糖對(duì)醇溶蛋白改性過程中產(chǎn)生MGO/GO和AGEs的影響，選擇五碳糖（木糖、阿拉伯糖）、六碳糖（果糖、葡萄糖）、多糖（麥芽糊精、葡聚糖、淀粉）和二糖（蔗糖）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，不同種類糖對(duì)醇溶蛋白糖基化過程中有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs量的變化趨勢(shì)較為一致。在體系中，MGO產(chǎn)生的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GO的量。不同糖產(chǎn)生MGO的量由大到小依次為果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖；不同糖產(chǎn)生GO的量由大到小依次為阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖；AGEs產(chǎn)生量由大到小依次為：木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖。其中，單糖產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物明顯多于多糖，這是由于在質(zhì)量相同時(shí)，大分子質(zhì)量的糖含有的羰基數(shù)目較少，不容易與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，而且空間效應(yīng)降低了反應(yīng)活性，支鏈的空間位阻效應(yīng)限制反應(yīng)的進(jìn)行[25]；并且反應(yīng)程度與糖的分子質(zhì)量有一定的正相關(guān)，開環(huán)比例高的短鏈糖具有高反應(yīng)性[26]。阿拉伯糖和木糖產(chǎn)生的GO和AGEs的量多于其他幾種糖。蔗糖產(chǎn)生的3 種有害產(chǎn)物明顯低于多糖，可能因?yàn)槎嗵且子谒猱a(chǎn)生還原性單糖葡萄糖。在同等改性條件下，優(yōu)先選擇多糖作為改性劑，以提高其安全性。而比較常用的3 種多糖改性劑，有害產(chǎn)物形成量依次為：淀粉＜葡聚糖＜麥芽糊精。

2.4 葡聚糖質(zhì)量濃度對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

由圖1可知，多糖在蛋白質(zhì)改性過程中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物較少，而且多糖改性比單糖和雙糖更能提高蛋白的功能性[27]，由于葡聚糖是葡萄糖單元脫水聚合而成的一種高分子葡萄糖聚合物，無臭無味，易溶于水，具有高親水性，因此常用葡聚糖作為改性劑[28]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用葡聚糖進(jìn)行改性條件優(yōu)化。

圖 2 葡聚糖質(zhì)量濃度對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 2 Effect of dextran concentration on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

由圖2可知，隨著葡聚糖質(zhì)量濃度的增加，MGO/GO和AGEs的生成量均呈上升趨勢(shì)，且3 個(gè)指標(biāo)不同葡聚糖質(zhì)量濃度之間存在顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)葡聚糖質(zhì)量濃度在1.0～2.0 mg/mL范圍，有害產(chǎn)物MGO/GO的增加幅度較大，尤其是MGO的生成的量遠(yuǎn)高于GO，MGO增加了約50%；當(dāng)質(zhì)量濃度由2.0 mg/mL增加到8.0 mg/mL，有害產(chǎn)物的量緩慢增加。牛麗亞等[6]在小麥胚芽蛋白糖基化改性反應(yīng)體系（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、pH 11.0、90 ℃、30 min）中發(fā)現(xiàn)，隨著葡聚糖比例的增加，接枝度呈上升趨勢(shì)，但產(chǎn)物的溶解性呈先上升后下降趨勢(shì)，在改性比例1∶1（相當(dāng)于葡聚糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL）時(shí)改性效果最佳。因此，在保證改性效果的前提下，應(yīng)該盡量選擇低質(zhì)量濃度的糖基化劑，如葡聚糖質(zhì)量濃度控制在2 mg/mL以內(nèi)以減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 3 反應(yīng)溫度對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

溫度越高，有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs的生成量均越多，各個(gè)產(chǎn)物在不同溫度產(chǎn)生量的差異性如圖3所示。從增長趨勢(shì)來看，80～100 ℃，體系中3 種有害產(chǎn)物大幅度增長，MGO和AGEs生成量分別增加了約85%和81%，

GO生成量增加了約50%。這是由于美拉德反應(yīng)屬于吸熱反應(yīng)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)鏈展開度增加，從而暴露出更多的游離氨基，其與糖的羰基反應(yīng)進(jìn)一步使反應(yīng)加劇[29]，有害產(chǎn)物的量隨之增大。由此，結(jié)合改性效果考慮，控制改性在較低溫度下進(jìn)行，可以降低體系中美拉德反應(yīng)有害產(chǎn)物的形成。據(jù)報(bào)道，大麥蛋白、玉米谷蛋白均能在90 ℃達(dá)到良好的改性效果[29-30]。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 4 Effect of reaction time on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

由圖4可知，糖基化反應(yīng)5 min，體系產(chǎn)生一定量有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs，其中MGO產(chǎn)生的量最高，約為GO的2 倍。5～20 min 3 種有害產(chǎn)物生成量快速增加，隨后20～120 min有害產(chǎn)物生成量呈現(xiàn)緩慢增加趨勢(shì)。除個(gè)別時(shí)間點(diǎn)外，3 種產(chǎn)物幾乎所有不同時(shí)刻均存在著顯著性差異（P＜0.05）。以葡聚糖對(duì)小麥胚芽蛋白改性30 min時(shí)（m（蛋白質(zhì)）∶m（葡聚糖）＝1∶1、pH 11.0、溫度110 ℃），接枝度和溶解性最好[6]。張蓓等[25]以葡聚糖對(duì)燕麥蛋白糖基化改性（90 ℃，pH 9.0），隨著時(shí)間的延長，接枝度和溶解度先增加后趨于平緩，反應(yīng)60 min時(shí)，蛋白質(zhì)-糖的接枝度和溶解度達(dá)到最大。這是由于反應(yīng)初期暴露在蛋白表面的游離氨基較快與糖反應(yīng)，后期由于大量葡聚糖支鏈的引入，其空間位阻限制了反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致美拉德反應(yīng)進(jìn)行緩慢，產(chǎn)物趨于平緩，接枝度和溶解性也趨于平緩。鑒于有害產(chǎn)物生成量隨著時(shí)間延長而增加的趨勢(shì)，改性時(shí)間不宜過長，長時(shí)間反應(yīng)既能增加有害產(chǎn)物又能降低改性效果。然而，20 min內(nèi)，有害產(chǎn)物尤其是MGO快速增加到接近峰值（138.21 μg/g），而僅僅靠縮短時(shí)間，安全性問題不可能得到解決，因此考慮添加天然抑制劑控制有害產(chǎn)物的形成。

2.7 抑制劑對(duì)改性條件下醇溶蛋白糖基化有害產(chǎn)物的抑制效應(yīng)

圖5c表明除辣椒素外（辣椒素有熒光吸收，干擾熒光性AGEs的測(cè)定），其他9 種抑制劑均能有效抑制AGEs的活性，抑制率依次為槲皮素＞大黃素＞蘆?。綜ys＞綠原酸＞染料木素＞兒茶素＞GSH＞阿魏酸，且抑制活性與添加濃度存在明顯量效關(guān)系（P＜0.05）。而阿魏酸對(duì)AGEs的抑制率較低，低于10%，且在0.05～1.00 mmol/L沒有顯著量效關(guān)系。結(jié)合圖5a、b可知，兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素4 種黃酮在濃度為0.10 mmol/L時(shí)對(duì)GO有一定的抑制效果，抑制率在14%～30%；而其他幾種天然抑制劑對(duì)GO沒有抑制活性；蘆丁、阿魏酸、染料木素、辣椒素和槲皮素對(duì)MGO有一定的抑制效果，抑制率在20%左右。本實(shí)驗(yàn)中天然抑制劑對(duì)醇溶蛋白體系中MGO/GO的抑制率較低，且隨添加量的變化沒有一定的規(guī)律性，可能是由于醇溶蛋白改性是在強(qiáng)堿性（pH 11.0）、高溫（100 ℃）條件下進(jìn)行的，天然抑制劑在高溫、堿性條件下不穩(wěn)定，難以捕獲MGO/GO形成加合產(chǎn)物，從而影響MGO和GO抑制效果。Moon等[31]研究不同pH值（2.7、7.0、10.0）槲皮素溶液在不同溫度（室溫、4、-20 ℃）條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在pH 10.0下反應(yīng)120 min，槲皮素完全降解；有研究報(bào)道綠原酸在堿性條件下更容易被氧化，釋放兩個(gè)質(zhì)子形成半醌結(jié)構(gòu)[32-33]；大黃素結(jié)構(gòu)中有3 個(gè)羥基，將其置于堿性溶液中會(huì)生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)合物[34]，破壞了大黃素原有的結(jié)構(gòu)，因此在堿性改性條件下，以上天然產(chǎn)物不宜作為美拉德反應(yīng)有害產(chǎn)物的抑制劑。

圖 5 抑制劑對(duì)改性條件下醇溶蛋白-葡聚糖體系糖基化有害產(chǎn)物的抑制效應(yīng)Fig. 5 Impacts of inhibitors on the formation of MGO/GO and AGEs in the gliadin-dextran reaction system

當(dāng)Cys質(zhì)量濃度在0.50～1.00 mg/mL時(shí)，對(duì)GO的抑制率維持在27%，而對(duì)MGO的抑制率高達(dá)82%～97%，對(duì)AGEs抑制率為72%～83%。而低于0.50 mg/mL時(shí)，對(duì)GO和AGEs沒有抑制效果。推測(cè)其原因可能是當(dāng)質(zhì)量濃度較小時(shí)，Cys參與到美拉德反應(yīng)中，隨著質(zhì)量濃度增大，Cys的巰基、氨基均能與MGO/GO發(fā)生反應(yīng)，從而減少體系中MGO和GO含量，同時(shí)抑制了AGEs的產(chǎn)生。與Cys相比，GSH對(duì)MGO的抑制率最高達(dá)到26%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Cys。Nomi等[35]報(bào)道了GSH可以通過谷氨酸殘基上的α-NH2基團(tuán)與GO反應(yīng)從而達(dá)到抑制GO的效果。而GSH對(duì)AGEs的抑制率高達(dá)62%～69%。推測(cè)可能為GSH的抗氧化作用抑制了AGEs生成。Zeng Jingmin等[36]研究表明GSH、Cys等有效抑制糖基化反應(yīng)的機(jī)制為Cys殘基與1,2-二羰基化合物反應(yīng)得到的硫醇醛加合物。因此，可以在醇溶蛋白改性過程中添加Cys或GSH作為有害產(chǎn)物的抑制劑。

2.8 抑制劑對(duì)改性醇溶蛋白乳化性能的影響

表 1 糖基化產(chǎn)物與抑制劑抑制產(chǎn)物的乳化活性Table 1 Emulsifying properties of glycosylated products as affected by added inhibitors

由表1可知，糖基化改性后醇溶蛋白的乳化活性得到顯著改善，提高了2.7 倍，改性效果良好；糖基化提高蛋白乳化性的主要原因是其溶解性的增加，同時(shí)糖鏈與蛋白質(zhì)的共價(jià)交聯(lián)使得蛋白質(zhì)的親水性增加，空間結(jié)構(gòu)松散，蛋白質(zhì)分子可以較快地吸附在油/水界面，表現(xiàn)出更高的乳化性[37]。添加抑制劑后兩種蛋白的乳化性依然顯著高于原蛋白，但明顯低于未添加抑制劑改性蛋白。添加了染料木素和Cys的蛋白，與單一改性組比，仍然保持了較高的乳化性能，且顯著降低MGO/GO和AGEs（圖5），與未改性的蛋白相比，乳化活性均有大幅度提高。推測(cè)抑制劑在抑制有害糖基化產(chǎn)物過程中對(duì)蛋白糖基化程度可能有一定影響，從而損失了一定的乳化性能，但在提高安全性的基礎(chǔ)上仍大大改善了蛋白乳化性能。

3 結(jié) 論

本研究建立了醇溶蛋白-糖體系，考察了糖種類、糖質(zhì)量濃度、改性時(shí)間和溫度等因素對(duì)改性條件下美拉德反應(yīng)有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs含量的影響；選擇兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、GSH和Cys等篩分有效抑制劑，并考察了添加抑制劑對(duì)改性蛋白乳化性的影響。

8 種糖基化劑（木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖）在醇溶蛋白改性過程中均能與蛋白反應(yīng)產(chǎn)生有害產(chǎn)物MGO/GO和AGEs。其中單糖產(chǎn)生的各種有害產(chǎn)物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多糖，尤其是MGO含量遠(yuǎn)高于GO。對(duì)比常用3 種多糖改性劑淀粉、葡聚糖、麥芽糊精，麥芽糊精產(chǎn)生的有害產(chǎn)物最多。

選擇葡聚糖作為改性劑，體系中MGO/GO和AGEs的生成量均隨著葡聚糖質(zhì)量濃度（1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）的增加、改性溫度（80、90、100、110 ℃）的升高以及改性時(shí)間的延長而增加，且趨勢(shì)均為先增加后趨于穩(wěn)定。

選擇兒茶素、槲皮素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、Cys、GSH 10 種抑制劑。由于改性是在強(qiáng)堿（pH 11.0）、高溫（100 ℃）條件下進(jìn)行的，導(dǎo)致兒茶素、槲皮素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，抑制效果較差。而Cys和GSH則有一定的抑制作用，尤其是Cys，當(dāng)Cys質(zhì)量濃度在0.50～1.00 mg/mL時(shí)，對(duì)GO的抑制率維持在27%，而對(duì)MGO的抑制率高達(dá)82%～97%，對(duì)AGEs抑制率為72%～83%。

選擇效果較好的抑制劑蘆丁、染料木素、GSH和Cys，研究抑制劑對(duì)改性蛋白乳化性的影響，結(jié)果表明添加抑制劑后的改性蛋白組與常規(guī)改性組比，乳化活性有所下降，但仍然遠(yuǎn)高于未改性的蛋白組。其中Cys、染料木素在降低有害產(chǎn)物的同時(shí)，仍然保持了較高的乳化性能。