仙參果酒體內(nèi)外抗氧化活性的研究

鄭飛，韓銘鑫，賀陽，張琰，喬夢丹，文連奎，戴雨霖，越皓，*

（1.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春，130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春，130118）

仙參果酒是以人參及仙人掌果為原料，按其發(fā)酵工藝條件所釀制而成。其中，人參是五加科植物人參（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根，人參皂苷是人參的主要有效成分，具有廣泛的藥理活性，如抗疲勞、抗糖尿病、抗抑郁等作用[1-3]。此外，有研究表明，人參皂苷能顯著提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力，具有較強的抗氧化作用[4]。仙人掌果為仙人掌科植物仙人掌的果實，果肉微酸甜，含有豐富的微量元素、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮類等營養(yǎng)物質(zhì)，具有行氣活血、提高免疫力、清除自由基等作用[5-7]。本研究前期工作中通過控制人參與仙人掌果加入量的比例來滿足發(fā)酵液體系的pH值，在酸性條件下及微生物發(fā)酵過程中可使人參中原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2等和原人參三醇型Re、Rg1等主要皂苷轉(zhuǎn)化生成稀有人參皂苷，如人參皂苷 Rh1、Rg2、F2、Rg3、CK、Rh2 等，研究表明[8-9]，這些稀有人參皂苷具有更顯著的藥理活性。因此，本研究在前期發(fā)酵工藝完成的基礎上，對仙參果酒中人參皂苷和花青素進行含量測定，并對體內(nèi)外抗氧化活性進行評價，為后續(xù)的功能食品和保健食品開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR 小鼠，50只，雄性，體重量 18 g～22 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心，許可證書編號為SCXK（吉）-2011-0004。

仙人掌果：海南富匯達農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；五年生人參：吉林省撫松縣萬良人參市場。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：西安熱默爾生物科技有限公司；AmberliteXAD-2大孔樹脂：Sigma公司；D-半乳糖：上海源葉生物有限公司；總抗氧化能力（total anti-oxidative capacity，T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

M200PRO型酶標儀：TECAN公司；Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)、Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；centrifuge 5804R型離心機：Eppendonf公司；T25 digital ULTRA-TURRAX數(shù)顯勻漿機：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 仙參果酒的制備

以質(zhì)量計，取鮮人參1份，清洗，切成2 mm～3 mm左右的薄片，加入3倍～5倍量水打漿，仙人掌果3份，去皮去刺后打漿，兩者混合；取鮮人參及仙人掌果混合漿液，加入白砂糖適量使含總糖量達到7%，按0.1%加入活化后的酵母，攪拌均勻，進行主發(fā)酵和后發(fā)酵；主發(fā)酵控制發(fā)酵溫度為18℃～20℃，主發(fā)酵1 d～12 d，酒精度達到4%vol～6%vol結(jié)束主發(fā)酵，過濾掉發(fā)酵液中的殘渣，后期發(fā)酵溫度10℃～12℃，時間30d～40d。發(fā)酵結(jié)束后，采用有機陶瓷膜過濾設備濾過，滅菌、裝瓶。

1.3.2 總皂苷的含量測定

精密量取仙參果酒50 mL，60℃水浴揮干，10 mL純化水溶解，吸取1.0 mL進行柱層析。在2 cm直徑層析柱內(nèi)裝入3 cm高AmberliteXAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0 mL已處理好的試樣溶液，用25 mL水洗柱，以洗去糖份等水溶性雜質(zhì)，棄去洗脫液，用25 mL70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，以此做顯色用。在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準確加入0.2mL 5%香草醛冰醋酸溶液，轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿，使殘渣都溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入5 mL具塞試管中，放在60℃以下水浴加熱10 min，取出，冷水冷卻后，準確加入冰醋酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長處與標準管一起進行比色測定。精密吸取人參皂苷 Re標準溶液（2.0 mg/mL）200 μL 置蒸發(fā)皿中，60℃水浴揮干，2.0 mL純化水溶解，吸取1.0 mL進行柱層析，方法同試樣，測定吸光度值。采用外標法求得供試品中總皂苷的含量。

1.3.3 總花青素的含量測定

精密稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品約5 mg于 5 mL量瓶中，用0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解，稀釋，并定容，搖勻，即得（每1 mL溶液中含有1 mg矢車菊-3-O-葡萄糖苷的標準品溶液）。精密量取經(jīng)發(fā)酵工藝制得的仙參果酒50 mL溶液，40℃水浴揮干，0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解于10 mL量瓶中，稀釋并定容，搖勻，過濾。以相應試劑作為空白試劑。于波長535 nm處測定吸光度值，采用外標法求得供試品中總花青素的含量。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 樣品溶液的制備

取經(jīng)發(fā)酵工藝制得的仙參果酒適量，離心（4 000 r/min，5 min），精密量取上清液2.5 mL溶液，40℃水浴揮干，0.1%鹽酸-80%乙醇（15∶85，體積比）溶解于2 mL量瓶中，稀釋成不同濃度的樣品溶液，用于還原力、DPPH自由基清除力、羥基自由基（·OH）清除力、O2-·清除力的測定。

1.3.4.2 還原力的測定

參照文獻[10-11]的方法，在10 mL比色管中加入1.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH6.6）、不同濃度（0.5 mL/mL～2.5 mL/mL）的樣品溶液2 mL和質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，50℃水浴鍋加熱20 min，冷卻，加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液混合后，以 3 000 r/min離心20 min，取上清液2 mL，加入2 mL純化水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵，混勻，放置10min，在700nm波長處測定吸光度（A700nm）。

1.3.4.3 DPPH自由基清除力的測定

參照文獻[12-13]的方法，將2 mL的DPPH溶液（0.04 mg/mL，95%乙醇）與不同濃度（0～1.0 mL/mL）的樣品溶液2 mL混勻后，在室溫下反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度（A1），其中每個質(zhì)量濃度做3個平行樣品，同時，將2 mL的DPPH溶液與樣品空白 2 mL混勻后測定吸光度（A0），將不同濃度的樣品溶液2 mL與95%乙醇2 mL混勻后測定吸光度（A2），按式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.3.4.4 羥基自由基（·OH）清除力的測定

參考王強等[14-15]的方法，在10 mL試管中依次加入不同濃度（0～1.0 mL/mL）的樣品溶液2 mL、0.6 mL 8.0 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 6.0 mmol/L的 H2O2溶液和2 mL 3 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，室溫靜置30 min，于37℃條件下水浴1 h，于510 nm波長處測定樣品吸光度（A1），以純化水代替樣品測得空白對照吸光度（A0），以純化水代替水楊酸測定樣品吸光度（A2），其中每個樣品濃度做3個平行樣品，按照公式（2）計算·OH的清除率。

1.3.4.5 O2-·清除力的測定

參照文獻[16]的方法，在10 mL比色管中加入樣品溶液 0.1 mL和 0.1 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.8 mL混勻，在25℃水浴10 min后加入0.1 mL 3mmol/L的鄰苯三酚溶液（25℃水浴預熱），混勻后立即在325 nm波長處測定吸光度，每30秒讀取A325nm，3 min后結(jié)束；以純化水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.8 mL調(diào)零；空白對照管以純化水代替樣品溶液。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按照公式（3）計算O2-·的清除率。

1.3.5 體內(nèi)抗氧化活性的測定

1.3.5.1 實驗動物條件和分組

實驗前取50只體質(zhì)量在18 g～22 g的雄性ICR小鼠，在實驗環(huán)境下給予基礎飼料飼養(yǎng)7 d，隨機分為空白組、模型組、仙參果酒的低、中、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余4組每天腹腔注射1.2 g/kg 98%D-半乳糖（采用生理鹽水配制），同時仙參果酒低、中、高劑量組按1、2、4 mL/（kg·d）的劑量灌胃仙參果酒，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水，每隔2天～3天稱重，連續(xù)灌胃35 d[17-21]。

1.3.5.2 生化指標的測定

實驗小鼠末次給藥24小時后摘眼球取血，4 000 r/min離心10 min，取上清液血清測試各生化指標。將小鼠頸椎脫臼處死，同時摘取小鼠肝臟組織，并用生理鹽水洗凈后用濾紙吸干稱重。用高速勻漿機制備10%的肝組織勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。所有處理均在4℃條件下完成。

樣品的總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

1.3.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 仙參果酒中功能成分的含量測定結(jié)果

2.1.1 總皂苷的含量測定結(jié)果

采用外標法求得3批樣品中的人參總皂苷含量平均值為（93.76±0.19）mg/100 mL。

2.1.2 總花青素的含量測定

采用外標法求得3批樣品的總花青素含量平均值為（10.66± 0.13）mg/100 mL。

2.2 仙參果酒的體外抗氧化活性研究

抗氧化劑的還原能力與其抗氧化活性之間存在一定的關(guān)系，抗氧化劑通過自身的還原能力給出電子而清除自由基，還原能力越強，抗氧化活性就越強。因此，我們可以通過測定還原能力來說明抗氧化能力的強弱[22]。本研究通過抗氧化物質(zhì)提供電子把鐵氰化鉀中Fe3+還原成Fe2+，而Fe2+在700 nm波長處有最大的吸光度，吸光度值越大說明樣品還原能力越強，抗氧化活性越高。仙參果酒的還原力見圖1。

圖1 仙參果酒的還原力Fig.1 Reducing power of cactus fruit ginseng wine

由圖1可知，在樣品濃度（0.5 mL/mL～2.5 mL/mL）范圍內(nèi)，還原力（Y）與仙參果酒的樣品濃度（X，mL/mL）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.173X+0.014（R2=0.997）。

DPPH自由基是很穩(wěn)定的N-中心自由基，與機體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可以用來評價化合物或是醫(yī)藥原料清除自由基或給電子的能力[23]。羥基自由基是公認的最活潑最有害的自由基，會嚴重損傷相鄰的生物分子造成脂質(zhì)過氧化[24]。因此，探討仙參果酒對DPPH自由基、·OH和O2-·的清除作用具有重要意義。仙參果酒清除DPPH自由基的能力見圖2。

如圖2，仙參果酒對DPPH自由基的清除率隨著仙參果酒樣品濃度的增加而逐漸增大，清除率在13.5%～69.9%，兩者呈正相關(guān)；當樣品濃度達到0.6 mL/mL及以上時，DPPH自由基清除效果變化不明顯。仙參果酒對·OH和O2-·的清除率的變化趨勢與其清除DPPH自由基相似，如圖3、圖4所示。

圖2 仙參果酒清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

圖3 仙參果酒清除·OH的能力Fig.3 Hydroxy radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

圖4 仙參果酒清除O2-·的能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of cactus fruit ginseng wine

2.3 仙參果酒的體內(nèi)抗氧化活性研究

D-半乳糖衰老模型被廣泛用于抗氧化活性的藥效學評價。CAT活力、MDA含量，SOD活力、T-AOC水平和GSH-Px活力是體內(nèi)最重要的抗氧化指標，可清除體內(nèi)的自由基[25]。仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響見表1。

由表1可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力都具有顯著性差異（P<0.05），其中 CAT、MDA、SOD、T-AOC 酶活力具有極顯著性差異（P<0.01），表明模型成立。與模型組比較，仙參果酒高、中、低3個給藥組中SOD、GSHPx酶活力均具有顯著性差異（P<0.05），CAT、MDA、TAOC酶活力均具有極顯著性差異（P<0.01）。

表1 仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse serum（±s，n=10）

表1 仙參果酒對小鼠血清CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse serum（±s，n=10）

注：與空白組比較，*為p<0.05差異顯著，**為p<0.01差異極顯著；與模型組比較，#為p<0.05差異顯著，##為p<0.01差異極顯著。

組別CAT/（U/mL）MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）T-AOC/（U/mL）GSH-Px/（U/mL）空白組 8.599 7±0.827 0 1.764 7±0.500 5 22.359 1±0.573 3 15.496 8±2.643 4 340.350 6±37.111 8模型組 2.119 7±0.274 2** 4.470 6±0.393 8** 20.047 1±1.470 6** 7.441 0±1.167 3** 275.638 2±62.784 7*高劑量組 9.530 2±1.260 0## 2.257 7±0.365 5## 21.565 9±0.689 2# 19.408 2±2.252 6## 329.495 1±12.354 8#中劑量組 9.726 3±1.023 2## 2.164 2±0.530 3## 21.405 4±1.020 9# 14.684 4±1.303 0## 316.262 3±12.396 0#低劑量組 8.626 8±1.493 3## 1.378 2±0.693 3## 21.497 4±0.528 4# 11.625 7±1.359 7## 305.490 9±13.641 4#

表2 仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse liver（±s，n=10）

表2 仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of cactus fruit ginseng wine on CAT，MDA，SOD，T-AOC and GSH-Px in mouse liver（±s，n=10）

注：與空白組比較，**為p<0.01差異極顯著；與模型組比較，##為p<0.01差異極顯著。

組別CAT/（U/mg prot）MDA/（nmol/mg prot）SOD/（U/mg prot）T-AOC/（U/mg prot）GSH-Px/（U/mg prot）空白組 18.030 6±1.377 2 0.464 3±0.080 4 14.073 6±0.575 5 0.249 3±0.058 7 607.920 8±21.821 3模型組 9.465 9±1.322 3** 1.973 6±0.536 7** 11.803 9±0.778 1** 0.154 8±0.033 5** 499.445 8±25.296 6**高劑量組 19.899 1±1.195 2## 1.280 1±0.168 7## 27.691 8±2.365 4## 0.331 2±0.100 6## 705.575 6±29.548 4##中劑量組 16.057 3±1.001 6## 0.499 2±0.165 3## 22.579 3±2.816 3## 0.387 6±0.095 4## 659.162 2±20.634 7##低劑量組 15.560 6±0.679 9## 0.586 2±0.201 2## 15.840 7±2.413 0## 0.284 9±0.091 8## 618.922 0±20.877 1##

仙參果酒對小鼠肝臟CAT、MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px含量的影響見表2。

由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠肝臟中CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力都具有極顯著性差異，表明模型成立。與模型組比較，人參仙人掌果保健酒高、中、低3個給藥組和陽性組CAT、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活力均具有極顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，仙參果酒高、中、低3個劑量可以提高肝臟中抗氧化酶的活力，清除肝臟中的過氧化物，仙參果酒具有較強的抗氧化能力。

3 結(jié)論

仙參果酒是人參和仙人掌果為原料，經(jīng)發(fā)酵工藝制得的保健酒，不僅降低了人參的燥性，同時轉(zhuǎn)化生成稀有人參皂苷，提高了其抗氧化、增強免疫力等活性，其中主要活性成分為人參皂苷[（93.76±0.19）mg/100 mL]和花青素[（10.66±0.13）mg/100 mL]。在后期的進一步研究中采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對仙參果酒中人參皂苷類成分進行檢測，結(jié)果表明檢測到27種人參皂苷，與發(fā)酵前比較，含量明顯減少有人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc，含量相對增加有人參皂苷為 Rb2 和Rd，同時生成了稀有人參皂苷，主要有Rh1、Rg2、Rg4/Rg6、F2、Rk3/Rh4、Rg3、Rh2、CK、Rk1/Rg5。有研究報道發(fā)現(xiàn)[26-28]，糖苷類化合物由于極性強、分子量大，口服吸收生物利用度相對較低，難以直接發(fā)揮藥效作用，而是在腸道中被腸道菌群代謝生成次級代謝產(chǎn)物或苷元，它們可能是人參在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用的活性物質(zhì)。

仙參果酒的體外抗氧化實驗結(jié)果表明，具有較高的還原力和自由基清除能力，其抗氧化能力與其質(zhì)量濃度有較好的量效關(guān)系，總抗氧化能力較強。同時本實驗通過皮下注射D-半乳糖構(gòu)建衰老小鼠模型，研究仙參果酒的體內(nèi)抗氧化活性，不同劑量的給藥組可以顯著提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝臟組織中的 CAT 活力、SOD、GSH-Px活力和 T-AOC（P<0.05），降低血清及肝臟組織MDA含量（P<0.05）。仙參果酒可以提高機體總抗氧化能力，提高抗氧化酶活性和還原性保護物質(zhì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，清除機體中的有毒有害物質(zhì)和自由基，從而減輕機體的損傷程度從而起到抗脂質(zhì)過氧化的作用。同時又通過減少機體中的有害物質(zhì)MDA含量，降低脂質(zhì)過氧化作用形成脂質(zhì)過氧化物含量，減緩機體膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強機體抵抗自由基攻擊的能力[27-29]。說明仙參果酒對小鼠體內(nèi)抗氧化/氧化平衡狀態(tài)有明顯的穩(wěn)定作用。本研究為仙參果酒在功能食品和保健食品領(lǐng)域的開發(fā)奠定基礎。