60Co-γ輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗生長和葉片生理和細胞結構的影響

李 ， ，

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江省 齊齊哈爾市161006)

苜蓿是世界上最重要、最有價值的栽培牧草之一，在全世界范圍內廣泛種植，對環(huán)境適應能力強，產量高，品質好，營養(yǎng)價值高，富含蛋白質、礦物質、維生素、氨基酸和微量元素等重要營養(yǎng)成分，可作為良好的精飼料替代品[1-2]。苜蓿的根系發(fā)達，能吸收到土壤深層的水分和養(yǎng)分，還可減少水土的流失，起到保持水土的作用[3]，對農牧業(yè)結構調整起到推動作用。

通過誘變育種能夠獲得有用的突變材料和變異植株[4]，誘變育種的方法有空間誘變、零磁空間誘變和輻射誘變等[5]，其中60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，目前國內外關于牧草的γ射線輻射誘變育種工作廣泛展開, 主要集中在牧草品種對射線的輻射敏感性及育種的適宜劑量[6-7]、生理生化的影響等[8-9]。植物體的形態(tài)結構和生理功能是統(tǒng)一的，功能的差異必然與相應的器官結構緊密相關，但利用60Co-γ射線輻射研究其對植物細胞結構的變化研究甚少。本文對輻射后龍牧806苜蓿幼苗生長、生理和葉片結構進行研究和分析，以期了解其幼苗生長生理和顯微結構對輻射的響應，從而更好的了解性狀突變的變化規(guī)律，為利用60Co-γ射線輻射選育苜蓿新品種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的‘龍牧806’苜蓿(MedicagosativaL.×Meliloidesruthenica(L.) Sojak. ‘Longmu 806’)干種子(2015年收獲，種子儲藏在低溫種子庫)為材料，其具有耐寒性、耐鹽堿，高產等特性，適合在低溫及鹽堿地上栽種。

1.2 方法

1.2.160Co-γ射線輻射處理60Co-γ輻射源由中國農業(yè)科學研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200和1 500 Gy 4個劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經處理的種子作為對照(CK)。

1.2.2幼苗的培養(yǎng) 取4種劑量的60Co-γ(600，900，1 200和1 500)射線輻射處理和未輻射的龍牧806苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在直徑為30 cm花盆(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進行混合)，每盆中均勻撒上30粒種子，每個劑量種植10盆，待幼苗生長至三葉一心期后備用。

1.2.3幼苗生長指標測定 選取培養(yǎng)一個月左右的龍牧806苜蓿幼苗，各輻射組和對照組中隨機選取10株具代表性的幼苗，利用刻度尺分別測量株高(cm)和主根長度(cm)，精確到0.01并計算其平均值。將幼苗的地上和地下分開，在60℃烘箱中烘干，測定地上和地下干重即為地上和地下生物量,并計算其根冠比。

根冠比= 植株的地下生物量/地上生物量

1.2.4生理指標測定 隨機選取各輻射劑量龍牧806苜蓿幼苗葉片并測定各生理指標，其中可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法，可溶性糖含量和丙二醛的測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法，相對電導率采用電導法[8]。各測定值均重復3次。

1.2.5透射電鏡切片制作及樣品觀察 選取對照組和輻射組相同葉位的葉片，取其中部約2 mm×4 mm樣品,立即投入含2.5% 戊二醛固定液中2 h, 用0.1 mol·L-1磷酸沖30 min，再經1% 鋨酸緩沖液固定2 h, 蒸餾水對樣品進行沖洗30 min, 系列濃度的乙醇脫水(各15 min)，環(huán)氧樹脂包埋，切成1 μm左右厚度的半薄切片，再經醋酸雙氧鈾50%酒精飽和溶液染色30 min，日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察和攝影，電壓100 kV。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0中單因素方差分析(one-way ANOVA)對植物生理特征指標進行差異顯著性檢驗。

采用隸屬函數(shù)法[9]，綜合評價不同輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿葉片生理的影響。

隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)，反隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi) =1-(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)(式中，Xi為指標測定值，Xmin、Xmax為所有實驗材料某項指標的最小值和最大值)。將隸屬值進行累加求出平均數(shù)，如公式：X= ΣU(Xi)/n，X是所求平均隸屬值。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗生長影響

60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗和地上長度及主根長度的變化見表1，隨著輻射劑量的增加，各輻射處理組的株高均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，主根長度出現(xiàn)降低的變化趨勢。幼苗的主根長度表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加而抑制作用增加，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗的主根平均長度分別比對照降低了21.93%，38.26%，60.19%和65.79%；600和900 Gy低劑量輻射促進龍牧806苜蓿幼苗的地上生長，分別比對照增加了25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy輻射劑量下抑制幼苗的地上生長。幼苗的生長對輻射反應比較敏感，主要通過幼苗的株高和主根長度的變化反應出來，不同劑量的60Co-γ射線輻射對幼苗生長的影響，表現(xiàn)為低劑量輻射促進了地上部分的幼苗生長，高輻射劑量抑制了其地上和地下部分的生長。

各輻射處理組幼苗地上和地下生物量隨輻射劑量的增加而減少(見表1)，根冠比出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗地上生物量分別比對照降低了21.74%，42.57%、68.57%和70.90，幼苗地下生物量分別比對照降低了13.45%，14.74%，58.87%和65.15%，根冠比分別比對照增加了10.56%，46.67%，30.82%和19.70%。輻射對龍牧806苜蓿幼苗地上生物量積累和根冠比產生了顯著的影響(P<0.05)，高輻射劑量對其地下生物量積累產生了顯著的影響(P<0.05)。

表1 60Co-γ輻射龍牧806苜蓿種子的幼苗生長指標的變化Table 1 The change of seedlings growth indexes of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak.‘Longmu 806’ seeds under 60Co-γ radiation

注: 同列不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)，下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below

2.2 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片生理的影響

在不同劑量60Co-γ輻射下的‘龍牧806’苜蓿葉片可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量變化見表2，60Co-γ輻照后的可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。輻射劑量為600 Gy時，‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量最高，1 200 Gy輻射劑量最低。600和900 Gy輻射劑量與對照組比其可溶性蛋白的含量分別增加了63.44%和31.16%，輻射劑量為1 200和1 500 Gy時，可溶性蛋白含量分別比對照降低了35.60%和75.31%。60Co-γ輻射的‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量均高于對照組，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，與對照組比脯氨酸含量分別增加了75.24%，38.09%，25.60%和12.19%，可溶性糖含量分別增加了82.41%，266.42%，236.07%和186.90%。60Co-γ輻射對可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的積累產生顯著影響(P<0.05)。

60Co-γ輻照后的丙二醛含量和相對電導率呈現(xiàn)增加的變化趨勢(見表2)，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，與對照組比丙二醛含量分別增加了93.63%，609.77%，695.70和714.93%，相對電導率與對照組比較分別增加了20.58%，93.95%，111.64%和129.98%。輻射處理丙二醛含量和相對電導率與對照比較差異顯著(P<0.05)，特別是在輻射劑量為1 200和1 500 Gy下，丙二醛含量和相對電導率增加幅度最大，說明此輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿葉片細胞質膜損傷加大，導致質膜透性加大。

2.3 隸屬函數(shù)分析

輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗的形態(tài)和生理變化產生不同的影響，同時各指標中存在著一定的相關性和差異性，在具體進行輻射評價時需要綜合考慮。將各個處理下測定‘龍牧806’苜蓿幼苗的形態(tài)和生理各指標的數(shù)據(jù)代入隸屬函數(shù)公式中計算出隸屬值，5項形態(tài)指標和5項生理指標的隸屬值見表3，隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片的滲透調節(jié)物質積累越多和膜脂透性的影響越小，根據(jù)隸屬函數(shù)平均值的大小，不同輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片生理指標影響的綜合排序依次為600 Gy>900 Gy>0 Gy>1 200 Gy>1 500 Gy，600～900 Gy輻射劑量可以應用于苜蓿的輻射誘變育種。

表2 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片五項生理指標變化Table 2 The five physiological indexes changes of seedling leaves of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak.‘Longmu 806’ seeds under 60Co-γ radiation

表3 ‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片生理指標隸屬值Table 3 The membership values of morphology and leaf physiology of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.)Sojak. ‘Longmu 806’ seedlings

2.4 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片超微結構差異性分析

植物在經過逆境環(huán)境條件下，葉片內部細胞結構、葉綠體和線粒體的形態(tài)結構會發(fā)生明顯的變化[10-12]。由圖1可以看出，不同劑量的60Co-γ射線處理‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗，其葉片細胞和葉綠體結構產生不同程度的影響。未輻射的‘龍牧806’苜蓿葉片細胞結構完整，形狀規(guī)則，多呈橢圓形，細胞壁平整，厚度均勻，葉綠體結構規(guī)則，膜輪廓完整，葉綠體緊貼細胞膜排列，基粒和基質片層結構完整，無淀粉粒出現(xiàn)，線粒體結構完整，可見明顯嵴的結構(見圖1的A～D)；低劑量600和900 Gy的‘龍牧806’苜蓿葉片細胞結構出現(xiàn)變化，細胞形態(tài)較規(guī)則，葉綠體數(shù)量減少，松散排列在細胞中(見圖1的E～H、I～L)，線粒體結構完整，可見嵴的結構，輻射劑量為900 Gy時，細胞出現(xiàn)輕微質壁分離現(xiàn)象，(見圖1的I～L)。高劑量1 200和1 500 Gy的‘龍牧806’苜蓿葉片，細胞及細胞內的結構較對照組和低劑量輻射組產生明顯的變化，細胞形狀不規(guī)則，細胞膨脹變大，壁較平整，厚度較均勻，出現(xiàn)嚴重的質壁分離現(xiàn)象，葉綠體數(shù)量減少，排列松散，片層結構比較完整，排列不規(guī)則，出現(xiàn)了大量個體大的淀粉粒，線粒體數(shù)目減少，嵴不明顯，(見圖1的M～P、Q～T)。不同劑量的60Co-γ射線處理‘龍牧806’苜蓿的幼苗，其葉片細胞、葉綠體、線粒體和淀粉粒等形態(tài)和數(shù)量產生了不同的變化，隨著輻射劑量的加大，葉片細胞和葉綠體形態(tài)出現(xiàn)明顯變形，類囊體片層嚴重扭轉，葉綠體被大量淀粉粒占據(jù)，線粒體數(shù)量明顯減少。

圖1 不同輻射條件下‘龍牧806’苜蓿葉片細胞形態(tài)結構Fig. 1 The morphological structure of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak. ‘Longmu 806’leaves cells under different radiation注：圖A～D、E～H、I～L、M～P、Q～T分別為輻射劑量為0，600，900，1 200，1 500 Gy葉片細胞形態(tài)結構。CW.細胞壁；Chl.葉綠體；MM.線粒體膜；G.基粒；GL.基粒片層；SL.基質片層；OG.嗜鋨顆粒；SG.淀粉粒；CM.葉綠體膜；Cr.嵴Note: A～D, E～H, I～ L, M～P and Q～T were cell morphologic structure of leaf under radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500Gy, respectively. CW.Cell wall; Chl.Chloroplast; MM.Mitochondria membrane; G.Granulation; GL.Granulation lamella; SL.substrate lamellae; OG.Osmium granule; SG.Starch granules; CM. Chloroplast membrane; Cr. Cristae

3 討論

植物在生長發(fā)育的過程中經常會遇到干旱、極端溫度、土壤鹽化、養(yǎng)分匱乏、重金屬脅迫等不良環(huán)境條件，植物會逐漸演化出各種各樣形態(tài)結構以適應逆境[12]。葉片是植物進化過程中對環(huán)境變化敏感的器官[13]，因此研究幼苗生長生理和葉片的結構特征可以反映出植物對逆境的適應能力。

幼苗的生長狀況是表現(xiàn)輻射生物學效應的一項重要參考指標[14]，低于900 Gy的輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿苗高度影響有一定的促進作用，高于1 200 Gy 的輻射對幼苗生長抑制作用顯著，高輻射劑量導致成苗期間幼苗矮化和根系短粗等明顯的變化。植株的生物量直接反映植株的生長狀況和植物光合作用產物積累的多少，隨著輻射劑量的增加，地上生物量和地下生物量均呈現(xiàn)下降的趨勢，與李瑜等人[8]研究60Co-γ輻射對桂花幼苗生長的影響結果一致。雖然60Co-γ射線處理對‘龍牧806’苜蓿地上生物量和地下生物量影響不同，但其都影響了光合同化物的合成[15]，致使降低其生物量的積累，植物地上部分生長則需要靠根部運輸水分，而且植物葉片蒸騰作用散失的水分量大，所以地上部分對水分虧缺產生的反應比根系對水分虧缺產生的反應更敏感，因此‘龍牧806’苜蓿幼苗的根冠比也發(fā)生了變化。輻射劑量為900 Gy時，根冠比達到最大，說明適當增加輻射劑量可以增加‘龍牧806’苜蓿幼苗根系所占比例，增強根系吸水能力，同時地上生物量的減少降低了水分的散失，使植物能夠長期保持不缺水的狀態(tài)，從而植物能夠更好地生長。

植物體內可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸是一種理想的滲透調節(jié)物質，逆境條件下通過主動積累這些物質對植物起著有效的保護作用[16]。以誘發(fā)突變?yōu)槟康牡妮椛涮幚?，會造成植物的生理損傷，600～1 500 Gy輻照處理后，‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量增加，表明該輻射范圍可以對‘龍牧806’苜蓿葉片產生不同程度的修復作用，但隨輻射劑量的增加，對損傷的修復能力減弱。600～900 Gy輻射‘龍牧806’苜蓿，可溶性蛋白積累量均高于對照組，這說明低輻射劑量可以促進‘龍牧806’苜蓿體內可溶性蛋白的積累，提高其對輻射損傷的能力。這與李鳳濤等人[17]研究60Co-γ輻射對白刺花幼苗生理的影響和張玉等人[18]研究60Co-γ輻射對菊苣幼苗生理影響結果基本一致。

植物在受到逆境脅迫時，膜脂過氧化產物MDA含量和相對電導率的高低與細胞膜的傷害程度呈正相關。本研究中，隨著輻射劑量的增加，丙二醛的含量以及相對電導率均表現(xiàn)為上升的變化趨勢，特別是在高劑量輻射下，‘龍牧806’苜蓿葉片丙二醛含量和相對電導率最高，說明在高輻射劑量下對‘龍牧806’苜蓿葉片細胞膜傷害比較大。李瑜[8]研究60Co-γ輻射對桂花幼苗生長及生理指標的影響也得出了相似的結果。

‘龍牧806’苜蓿幼苗生長、生物量積累、游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量等滲透調節(jié)物質和相對電導率、MDA含量均能反映輻射對植物生長、滲透調節(jié)和細胞膜受到的傷害程度，同時各指標中存在著一定的相關性和差異性，在具體進行評價時需要綜合考慮[18]。輻射處理下幼苗的生長和生理指標變化不同，應用單一指標對其輻射的反應不能準確評價。在4種輻射劑量中，60Co-γ輻射劑量為600～900 Gy范圍內對‘龍牧806’苜蓿的生長和生理產生正向影響，而1 200～1 500 Gy對‘龍牧806’苜蓿的生長和生理產生負向影響。

植物在不同的逆境環(huán)境下，葉片細胞的超微結構會發(fā)生明顯的變化。試驗通過不同劑量的60Co-γ射線處理后其葉片內部的結構進行透射電鏡的分析，經過高輻射過后‘龍牧806’苜蓿的葉片內部的結構出現(xiàn)變形嚴重，細胞發(fā)生質壁分離的現(xiàn)象，葉片細胞內部葉綠體結構松散、類囊體扭曲，淀粉粒的數(shù)量變大變多。這與張興芬等人[19]研究60Co-γ輻照對三七葉片細胞形態(tài)結構、葉綠體和線粒體的形態(tài)和結構的變化和王順才等人[20]研究干旱脅迫下3種蘋果屬植物葉片葉綠體超微結構的影響的結果基本一致。

4 結論

60Co-γ射線對‘龍牧806’苜蓿種子的輻射效應明顯，主要表現(xiàn)為低輻射處理促進‘龍牧806’苜蓿幼苗的生長、滲透調節(jié)物質積累，細胞膜的傷害程度和細胞形態(tài)、線粒體和葉綠體等結構影響比較小，而高輻射處理使幼苗生長變緩，株高變矮，可溶性蛋白和脯氨酸含量降低，細胞膜的傷害程度和細胞形態(tài)、線粒體和葉綠體結構受到不同程度的改變。綜合分析幼苗生長、生理和細胞超微結構，結果表明 600～900 Gy是‘龍牧806’苜蓿60Co-γ射線誘變育種較為合適的劑量范圍。