根瘤共生對紫花苜?？购缘挠绊?/h1>
2018-08-24 04:37:52劉雨詩
草地學(xué)報 2018年3期
劉雨詩， ， ， ， *， *
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院 草業(yè)科學(xué)系， 陜西 楊凌712100； 2. 陜西省草原工作站， 陜西 西安710016；3. 陜西省林業(yè)科學(xué)研究院， 陜西 西安710082)
1 材料與方法
1.1 試驗材料
本研究采用保定紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Baoding’)種子為供試材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。經(jīng)1% NaClO消毒后置于鋪有濕潤濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，保持濾紙濕潤，發(fā)芽5 d后移至西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)溫室中培養(yǎng)(溫度：晝/夜 30±5℃ / 20±5℃; 濕度：晝/夜 55±5% / 70±5%)。幼苗處理分為2組：接種苜蓿專用根瘤菌多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)的紫花苜蓿(AN)和不接種根瘤菌的紫花苜蓿(NN)。AN澆改良霍格蘭氏無氮營養(yǎng)液，NN澆全氮營養(yǎng)液[27]以確保其正常生長。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌苜蓿AN和無根瘤菌苜蓿NN的氮含量，碳含量，以及磷含量無顯著差異[28]。生長60 d的幼苗進(jìn)行第一次刈割，90 d后進(jìn)行第2次刈割，到120 d時，進(jìn)行低溫脅迫試驗。
1.2 低溫處理
當(dāng)苜蓿幼苗生長到120 d后，隨機(jī)選擇AN和NN苜蓿，放入植物培養(yǎng)箱進(jìn)行-6℃低溫處理12 h。
1.3 樣品采集
紫花苜蓿地上部分和地下部分分別采樣，共設(shè)置7個采樣時間點，分別為低溫脅迫0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h時進(jìn)行采樣。試驗設(shè)置3次重復(fù)。除電導(dǎo)率與葉綠素指標(biāo)使用鮮樣外，其余指標(biāo)測定均使用凍樣。用錫箔紙包好采集的樣品，迅速放入液氮10 min，存放于-80℃冰箱，待后續(xù)測量生理指標(biāo)。
1.4 指標(biāo)測定方法
1.5 數(shù)據(jù)分析
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統(tǒng)計軟件分析，獨立樣本t檢驗進(jìn)行方差分析，設(shè)置相應(yīng)置信區(qū)間百分比95%。使用GraphPad Prism 5作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 紫花苜蓿根際狀態(tài)
不同處理下紫花苜蓿的根際結(jié)瘤狀況不同，其中AN根部有粉色根瘤，而NN根部無根瘤(見圖1)。
圖1 AN和NN根部情況Fig.1 Root situation of AN and NN注：AN表示接種根瘤菌苜蓿(紅色箭頭指出了粉色根瘤)；NN表示不接種根瘤菌苜蓿，下同Note: AN indicates activated-nodules alfalfa (Red arrows show the pink nodules in the roots of AN);NN indicates non-nodules alfalfa. The same as below
2.2 根瘤對紫花苜蓿幼苗細(xì)胞膜的影響
細(xì)胞的膜系統(tǒng)是植物遭遇低溫傷害的首要部位，隨脅迫時間加長，AN和NN的葉片相對電導(dǎo)率均呈逐漸上升趨勢。盡管NN在6 h至12 h間，葉片電導(dǎo)率出現(xiàn)波動，但總體上均高于AN。在低溫脅迫6 h、8 h、10 h時，AN的葉片電導(dǎo)率顯著低于NN(P<0.05)(見圖2)。
在正常生長條件下，AN和NN的丙二醛含量差異不顯著；低溫脅迫期間，2組苜蓿的地上部分和地下部分丙二醛含量都隨著脅迫時間的延長而升高，說明低溫對AN和NN細(xì)胞膜的損傷逐漸增大，并且脅迫后期，AN顯著低于NN(P<0.05)(見圖3)。
圖2 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of nodulation on relative conductivity of alfalfa leaf under cold stress注：圖中*表示差異顯著(P<0.05)。下同Note：* indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below
圖3 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿地上部分和地下部分丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of nodulation on MDA content of alfalfa shoot and root under cold stress注：圖a表示地上部分，圖b表示地下部分Note: Fig.a indicates shoot part of alfalfa; Fig.b indicates root part of alfalfa
2.3 根瘤對紫花苜蓿細(xì)胞滲透勢的影響
低溫脅迫前，AN和NN的滲透勢差異不顯著。脅迫開始后，AN和NN滲透勢都呈下降趨勢。AN滲透勢6 h后下降趨勢較明顯，NN的滲透勢下降相對平緩。在脅迫4 h、8 h、10 h、12 h時，AN的滲透勢顯著低于NN(P<0.05)，在12 h低溫脅迫下， AN的滲透勢比NN低0.74 Mpa(見圖4)。
圖4 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿滲透勢的影響Fig.4 Effect of nodulation on osmotic potential of alfalfa under cold stress
2.4 根瘤對紫花苜蓿胞內(nèi)活性氧積累及抗氧化劑含量的影響
低溫脅迫處理后的紫花苜蓿胞內(nèi)活性氧含量增加，非酶抗氧化物質(zhì)還原性谷胱甘肽(GSH)逐漸升高(見圖5、圖6與圖7)。
過氧化氫含量隨低溫脅迫時間的延長而積累。地上部分過氧化氫含量比根積累更快。脅迫6 h以后，AN地上和地下部分產(chǎn)生的過氧化氫顯著低于NN。在0 h時， AN地上部分的過氧化氫含量顯著高于NN，然后二者在脅迫2 h后處于同一水平，但在8 h，12 h時，NN過氧化氫含量超過AN中含量，且差異顯著(P<0.05)。地下部分低溫脅迫中，前6 h二者差異不顯著，脅迫后8 h開始，AN的過氧化氫含量顯著低于NN(P<0.05),見圖5。
超氧陰離子自由基含量隨低溫脅迫時間的延長呈波動上升趨勢。雖然AN和NN超氧陰離子自由基含量在某些時間點無顯著差異，但總體NN含量高于AN。地上部分中，NN相比AN在4 h、10 h和12 h時含量較高(P<0.05)。地下部分中，NN相比AN在4 h，6 h和12 h時含量較高(P<0.05)，見圖6。
GSH作為非酶氧化清除劑，隨脅迫時間延長，在植物體內(nèi)含量逐漸增加。低溫脅迫6 h后，AN體內(nèi)積累更多的GSH。AN地上部分GSH含量在脅迫6 h、8 h、10 h時顯著高于NN，分別為NN的1.25，1.12和1.37倍(P<0.05)；AN根中GSH含量在處理6 h、8 h、12 h時顯著高于NN，分別為NN的1.33，2.33和1.28倍(P<0.05)，見圖7。
試驗中隨低溫脅迫時間延長，AN和NN的VC含量呈下降趨勢，但與NN相比，AN中VC含量更高。根瘤菌處理組AN地上部分的VC含量在4 h、10 h、12 h時顯著高于NN(P<0.05)，地下部分VC含量在2 h時顯著高于NN(P<0.05)(見圖8)。
圖5 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿過氧化氫含量的影響Fig.5 Effect of nodulation on hydrogen peroxide content of alfalfa shoot and root under cold stress注：a表示地上部分，b表示地下部分Note: a indicates shoot part of alfalfa; b indicates root part of alfalfa
圖6 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿超氧陰離子自由基含量的影響Fig.6 Effect of nodulation on superoxide anion radical content of alfalfa shoot and root under cold stress
圖7 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿還原性谷胱甘肽含量的影響Fig.7 Effect of nodulation on GSH content of alfalfa shoot and root under cold stress
圖8 低溫脅迫下根瘤對紫花苜?？箟难酼C含量的影響Fig.8 Effect of nodulation on VC content of alfalfa shoot and root under cold stress
2.5 根瘤對紫花苜蓿葉綠素含量的影響
低溫脅迫后，AN葉綠素含量先增加后減少；NN葉綠素含量先減少，后略微增加，又減少，總體呈下降趨勢。AN的葉綠素a含量在4 h、6 h、8 h時顯著高于NN(P<0.05)；處理組AN的葉綠素b含量在4 h、6 h時顯著高于NN(P<0.05)；與NN相比，AN的葉綠素總量在脅迫中期維持在較高水平，在4 h和8 h時二者差異顯著(P<0.05)(圖9)。
圖9 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉綠素a，b及葉綠素總量的影響Fig.9 Effect of nodulation on chlorophyll a, b and total chlorophyll content of alfalfa shoot under cold stress注：a表示葉綠素a含量；b表示葉綠素b含量；c表示葉綠素總含量Note: a indicates the chlorophyll a content; b indicates the chlorophyll b content; c indicates the total chlorophyll content
3 討論
低溫逆境下植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)首先受到損傷。膜上不飽和脂肪酸氧化降解，膜孔隙變大，胞內(nèi)離子外滲，相對電導(dǎo)率升高，故常通過相對電導(dǎo)率的變化判斷細(xì)胞膜受傷害情況，越高的相對電導(dǎo)率預(yù)示著膜系統(tǒng)受損越嚴(yán)重[36]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，電導(dǎo)率含量升高，但AN的電導(dǎo)率較NN的要低，說明NN植物細(xì)胞內(nèi)有更多的離子外滲，與李莎莎等[27]關(guān)于根瘤共生苜蓿在低溫脅迫下電導(dǎo)率變化研究結(jié)果一致。MDA是細(xì)胞膜膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，能強(qiáng)烈的與胞內(nèi)各物質(zhì)反應(yīng)，它的積累還會進(jìn)一步加劇對酶和膜的損傷，所以抗逆生理研究中也常用MDA作為氧化損傷指標(biāo)[37-39]。AN和NN的MDA含量隨脅迫時間延長逐漸上升，但NN的MDA積累速率明顯快于AN，說明相對于不接種根瘤菌的紫花苜蓿NN，接種根瘤菌紫花苜蓿AN 能降低MDA產(chǎn)生速率以減少因低溫造成的細(xì)胞膜損傷。
低溫脅迫下，植物自身會產(chǎn)生大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，引起植物葉片滲透勢降低；滲透勢越低的植物在逆境中的調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)[40]。在持續(xù)低溫脅迫下，AN比NN保持更低的滲透勢，說明紫花苜蓿在根瘤共生的情況下，對外界脅迫產(chǎn)生了更快更強(qiáng)的滲透保護(hù)作用，能更好的維持自身細(xì)胞膜穩(wěn)定性。
正常生長條件下，植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡的穩(wěn)態(tài)中，當(dāng)植物遭遇脅迫時，這種穩(wěn)態(tài)會被打破，導(dǎo)致自由基在胞內(nèi)迅速積累，清除劑含量下降，破壞膜質(zhì)的雙層結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷，促使植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制植物生長[41]?；钚匝醴肿尤绯蹶庪x子自由基與過氧化氫的累積會導(dǎo)致植物細(xì)胞氧化損傷[42]。低溫脅迫下，AN比NN具有較低的過氧化氫含量和超氧陰離子自由基含量，表明根瘤菌共生能在一定程度上抑制活性氧的產(chǎn)生。自由基的大量積累，會使不飽和脂肪酸鏈降解，破壞細(xì)胞膜，致使MDA積累，電解質(zhì)滲出[43-44]，這與本試驗研究發(fā)現(xiàn)的脅迫后NN積累更多活性氧自由基，產(chǎn)生更多MDA含量和相對電導(dǎo)率的結(jié)果相一致，說明根瘤與紫花苜?；プ骱?，能增加苜蓿細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。
抗逆性強(qiáng)的植株比抗逆性弱的植株擁有更高的抗氧化劑水平[45-46]。當(dāng)植物遭受脅迫后，GSH含量的提高，可抑制不飽和脂肪酸生物膜分解，清除氧化劑羥基和H2O2，防止膜質(zhì)過氧化，增強(qiáng)植物抗逆性[47]。已有研究結(jié)果表明，耐低溫轉(zhuǎn)基因番茄比野生型番茄在低溫下產(chǎn)生更高的GSH含量[48]。本試驗結(jié)果表明，在低溫脅迫6 h后，根瘤固氮的AN苜蓿，GSH含量顯著升高并維持在高水平，這說明與根瘤互作后，GSH含量能在植物遭受低溫脅迫后顯著升高，增強(qiáng)苜蓿的耐寒性。
VC是植物體內(nèi)的一種重要維生素，同時具有抗氧化作用，其含量的多少與植物營養(yǎng)價值、抗逆、抗衰老能力相關(guān)，不適宜的溫度將導(dǎo)致VC含量下降[49]。本研究中AN和NN在根際中的VC含量于脅迫后期大致相當(dāng)，但在地上部分中，AN的VC含量在脅迫后期顯著比NN中的含量高，表明在較長時間的低溫下，根瘤固氮可以在一定程度范圍內(nèi)延緩植物VC含量的損失，緩解植物在逆境下的不利狀態(tài)。
低溫則影響植物的光合作用。葉綠素作為參與光合作用的核心物質(zhì)，在低溫下會被抑制生物合成，含量降低，常用來反應(yīng)植株葉片受脅迫程度[50-51]。本試驗在同等脅迫情況下，與根瘤菌共生的苜蓿植株較不接種根瘤菌的植株，表現(xiàn)出更緩慢的葉綠素分解速度，這說明接種根瘤菌在一定程度上能降低低溫脅迫給植物葉片帶來的損傷，延緩低溫導(dǎo)致的葉片光合損失。
4 結(jié)論
與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮一定程度上能增加紫花苜蓿的滲透調(diào)節(jié)能力，維持光合作用水平和氧化物清除能力，從而提高紫花苜蓿對低溫脅迫環(huán)境的抵抗力，有助于提高紫花苜蓿在寒冷地區(qū)的生存能力。
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1 材料與方法
1.1 試驗材料
本研究采用保定紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Baoding’)種子為供試材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。經(jīng)1% NaClO消毒后置于鋪有濕潤濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，保持濾紙濕潤，發(fā)芽5 d后移至西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)溫室中培養(yǎng)(溫度：晝/夜 30±5℃ / 20±5℃; 濕度：晝/夜 55±5% / 70±5%)。幼苗處理分為2組：接種苜蓿專用根瘤菌多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)的紫花苜蓿(AN)和不接種根瘤菌的紫花苜蓿(NN)。AN澆改良霍格蘭氏無氮營養(yǎng)液，NN澆全氮營養(yǎng)液[27]以確保其正常生長。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌苜蓿AN和無根瘤菌苜蓿NN的氮含量，碳含量，以及磷含量無顯著差異[28]。生長60 d的幼苗進(jìn)行第一次刈割，90 d后進(jìn)行第2次刈割，到120 d時，進(jìn)行低溫脅迫試驗。
1.2 低溫處理
當(dāng)苜蓿幼苗生長到120 d后，隨機(jī)選擇AN和NN苜蓿，放入植物培養(yǎng)箱進(jìn)行-6℃低溫處理12 h。
1.3 樣品采集
紫花苜蓿地上部分和地下部分分別采樣，共設(shè)置7個采樣時間點，分別為低溫脅迫0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h時進(jìn)行采樣。試驗設(shè)置3次重復(fù)。除電導(dǎo)率與葉綠素指標(biāo)使用鮮樣外，其余指標(biāo)測定均使用凍樣。用錫箔紙包好采集的樣品，迅速放入液氮10 min，存放于-80℃冰箱，待后續(xù)測量生理指標(biāo)。
1.4 指標(biāo)測定方法
1.5 數(shù)據(jù)分析
試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統(tǒng)計軟件分析，獨立樣本t檢驗進(jìn)行方差分析，設(shè)置相應(yīng)置信區(qū)間百分比95%。使用GraphPad Prism 5作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 紫花苜蓿根際狀態(tài)
不同處理下紫花苜蓿的根際結(jié)瘤狀況不同，其中AN根部有粉色根瘤，而NN根部無根瘤(見圖1)。
圖1 AN和NN根部情況Fig.1 Root situation of AN and NN注：AN表示接種根瘤菌苜蓿(紅色箭頭指出了粉色根瘤)；NN表示不接種根瘤菌苜蓿，下同Note: AN indicates activated-nodules alfalfa (Red arrows show the pink nodules in the roots of AN);NN indicates non-nodules alfalfa. The same as below
2.2 根瘤對紫花苜蓿幼苗細(xì)胞膜的影響
細(xì)胞的膜系統(tǒng)是植物遭遇低溫傷害的首要部位，隨脅迫時間加長，AN和NN的葉片相對電導(dǎo)率均呈逐漸上升趨勢。盡管NN在6 h至12 h間，葉片電導(dǎo)率出現(xiàn)波動，但總體上均高于AN。在低溫脅迫6 h、8 h、10 h時，AN的葉片電導(dǎo)率顯著低于NN(P<0.05)(見圖2)。
在正常生長條件下，AN和NN的丙二醛含量差異不顯著；低溫脅迫期間，2組苜蓿的地上部分和地下部分丙二醛含量都隨著脅迫時間的延長而升高，說明低溫對AN和NN細(xì)胞膜的損傷逐漸增大，并且脅迫后期，AN顯著低于NN(P<0.05)(見圖3)。
圖2 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of nodulation on relative conductivity of alfalfa leaf under cold stress注：圖中*表示差異顯著(P<0.05)。下同Note：* indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below
圖3 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿地上部分和地下部分丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of nodulation on MDA content of alfalfa shoot and root under cold stress注：圖a表示地上部分，圖b表示地下部分Note: Fig.a indicates shoot part of alfalfa; Fig.b indicates root part of alfalfa
2.3 根瘤對紫花苜蓿細(xì)胞滲透勢的影響
低溫脅迫前，AN和NN的滲透勢差異不顯著。脅迫開始后，AN和NN滲透勢都呈下降趨勢。AN滲透勢6 h后下降趨勢較明顯，NN的滲透勢下降相對平緩。在脅迫4 h、8 h、10 h、12 h時，AN的滲透勢顯著低于NN(P<0.05)，在12 h低溫脅迫下， AN的滲透勢比NN低0.74 Mpa(見圖4)。
圖4 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿滲透勢的影響Fig.4 Effect of nodulation on osmotic potential of alfalfa under cold stress
2.4 根瘤對紫花苜蓿胞內(nèi)活性氧積累及抗氧化劑含量的影響
低溫脅迫處理后的紫花苜蓿胞內(nèi)活性氧含量增加，非酶抗氧化物質(zhì)還原性谷胱甘肽(GSH)逐漸升高(見圖5、圖6與圖7)。
過氧化氫含量隨低溫脅迫時間的延長而積累。地上部分過氧化氫含量比根積累更快。脅迫6 h以后，AN地上和地下部分產(chǎn)生的過氧化氫顯著低于NN。在0 h時， AN地上部分的過氧化氫含量顯著高于NN，然后二者在脅迫2 h后處于同一水平，但在8 h，12 h時，NN過氧化氫含量超過AN中含量，且差異顯著(P<0.05)。地下部分低溫脅迫中，前6 h二者差異不顯著，脅迫后8 h開始，AN的過氧化氫含量顯著低于NN(P<0.05),見圖5。
超氧陰離子自由基含量隨低溫脅迫時間的延長呈波動上升趨勢。雖然AN和NN超氧陰離子自由基含量在某些時間點無顯著差異，但總體NN含量高于AN。地上部分中，NN相比AN在4 h、10 h和12 h時含量較高(P<0.05)。地下部分中，NN相比AN在4 h，6 h和12 h時含量較高(P<0.05)，見圖6。
GSH作為非酶氧化清除劑，隨脅迫時間延長，在植物體內(nèi)含量逐漸增加。低溫脅迫6 h后，AN體內(nèi)積累更多的GSH。AN地上部分GSH含量在脅迫6 h、8 h、10 h時顯著高于NN，分別為NN的1.25，1.12和1.37倍(P<0.05)；AN根中GSH含量在處理6 h、8 h、12 h時顯著高于NN，分別為NN的1.33，2.33和1.28倍(P<0.05)，見圖7。
試驗中隨低溫脅迫時間延長，AN和NN的VC含量呈下降趨勢，但與NN相比，AN中VC含量更高。根瘤菌處理組AN地上部分的VC含量在4 h、10 h、12 h時顯著高于NN(P<0.05)，地下部分VC含量在2 h時顯著高于NN(P<0.05)(見圖8)。
圖5 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿過氧化氫含量的影響Fig.5 Effect of nodulation on hydrogen peroxide content of alfalfa shoot and root under cold stress注：a表示地上部分，b表示地下部分Note: a indicates shoot part of alfalfa; b indicates root part of alfalfa
圖6 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿超氧陰離子自由基含量的影響Fig.6 Effect of nodulation on superoxide anion radical content of alfalfa shoot and root under cold stress
圖7 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿還原性谷胱甘肽含量的影響Fig.7 Effect of nodulation on GSH content of alfalfa shoot and root under cold stress
圖8 低溫脅迫下根瘤對紫花苜?？箟难酼C含量的影響Fig.8 Effect of nodulation on VC content of alfalfa shoot and root under cold stress
2.5 根瘤對紫花苜蓿葉綠素含量的影響
低溫脅迫后，AN葉綠素含量先增加后減少；NN葉綠素含量先減少，后略微增加，又減少，總體呈下降趨勢。AN的葉綠素a含量在4 h、6 h、8 h時顯著高于NN(P<0.05)；處理組AN的葉綠素b含量在4 h、6 h時顯著高于NN(P<0.05)；與NN相比，AN的葉綠素總量在脅迫中期維持在較高水平，在4 h和8 h時二者差異顯著(P<0.05)(圖9)。
圖9 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉綠素a，b及葉綠素總量的影響Fig.9 Effect of nodulation on chlorophyll a, b and total chlorophyll content of alfalfa shoot under cold stress注：a表示葉綠素a含量；b表示葉綠素b含量；c表示葉綠素總含量Note: a indicates the chlorophyll a content; b indicates the chlorophyll b content; c indicates the total chlorophyll content
3 討論
低溫逆境下植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)首先受到損傷。膜上不飽和脂肪酸氧化降解，膜孔隙變大，胞內(nèi)離子外滲，相對電導(dǎo)率升高，故常通過相對電導(dǎo)率的變化判斷細(xì)胞膜受傷害情況，越高的相對電導(dǎo)率預(yù)示著膜系統(tǒng)受損越嚴(yán)重[36]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，電導(dǎo)率含量升高，但AN的電導(dǎo)率較NN的要低，說明NN植物細(xì)胞內(nèi)有更多的離子外滲，與李莎莎等[27]關(guān)于根瘤共生苜蓿在低溫脅迫下電導(dǎo)率變化研究結(jié)果一致。MDA是細(xì)胞膜膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，能強(qiáng)烈的與胞內(nèi)各物質(zhì)反應(yīng)，它的積累還會進(jìn)一步加劇對酶和膜的損傷，所以抗逆生理研究中也常用MDA作為氧化損傷指標(biāo)[37-39]。AN和NN的MDA含量隨脅迫時間延長逐漸上升，但NN的MDA積累速率明顯快于AN，說明相對于不接種根瘤菌的紫花苜蓿NN，接種根瘤菌紫花苜蓿AN 能降低MDA產(chǎn)生速率以減少因低溫造成的細(xì)胞膜損傷。
低溫脅迫下，植物自身會產(chǎn)生大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，引起植物葉片滲透勢降低；滲透勢越低的植物在逆境中的調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)[40]。在持續(xù)低溫脅迫下，AN比NN保持更低的滲透勢，說明紫花苜蓿在根瘤共生的情況下，對外界脅迫產(chǎn)生了更快更強(qiáng)的滲透保護(hù)作用，能更好的維持自身細(xì)胞膜穩(wěn)定性。
正常生長條件下，植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡的穩(wěn)態(tài)中，當(dāng)植物遭遇脅迫時，這種穩(wěn)態(tài)會被打破，導(dǎo)致自由基在胞內(nèi)迅速積累，清除劑含量下降，破壞膜質(zhì)的雙層結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷，促使植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制植物生長[41]?；钚匝醴肿尤绯蹶庪x子自由基與過氧化氫的累積會導(dǎo)致植物細(xì)胞氧化損傷[42]。低溫脅迫下，AN比NN具有較低的過氧化氫含量和超氧陰離子自由基含量，表明根瘤菌共生能在一定程度上抑制活性氧的產(chǎn)生。自由基的大量積累，會使不飽和脂肪酸鏈降解，破壞細(xì)胞膜，致使MDA積累，電解質(zhì)滲出[43-44]，這與本試驗研究發(fā)現(xiàn)的脅迫后NN積累更多活性氧自由基，產(chǎn)生更多MDA含量和相對電導(dǎo)率的結(jié)果相一致，說明根瘤與紫花苜?；プ骱?，能增加苜蓿細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。
抗逆性強(qiáng)的植株比抗逆性弱的植株擁有更高的抗氧化劑水平[45-46]。當(dāng)植物遭受脅迫后，GSH含量的提高，可抑制不飽和脂肪酸生物膜分解，清除氧化劑羥基和H2O2，防止膜質(zhì)過氧化，增強(qiáng)植物抗逆性[47]。已有研究結(jié)果表明，耐低溫轉(zhuǎn)基因番茄比野生型番茄在低溫下產(chǎn)生更高的GSH含量[48]。本試驗結(jié)果表明，在低溫脅迫6 h后，根瘤固氮的AN苜蓿，GSH含量顯著升高并維持在高水平，這說明與根瘤互作后，GSH含量能在植物遭受低溫脅迫后顯著升高，增強(qiáng)苜蓿的耐寒性。
VC是植物體內(nèi)的一種重要維生素，同時具有抗氧化作用，其含量的多少與植物營養(yǎng)價值、抗逆、抗衰老能力相關(guān)，不適宜的溫度將導(dǎo)致VC含量下降[49]。本研究中AN和NN在根際中的VC含量于脅迫后期大致相當(dāng)，但在地上部分中，AN的VC含量在脅迫后期顯著比NN中的含量高，表明在較長時間的低溫下，根瘤固氮可以在一定程度范圍內(nèi)延緩植物VC含量的損失，緩解植物在逆境下的不利狀態(tài)。
低溫則影響植物的光合作用。葉綠素作為參與光合作用的核心物質(zhì)，在低溫下會被抑制生物合成，含量降低，常用來反應(yīng)植株葉片受脅迫程度[50-51]。本試驗在同等脅迫情況下，與根瘤菌共生的苜蓿植株較不接種根瘤菌的植株，表現(xiàn)出更緩慢的葉綠素分解速度，這說明接種根瘤菌在一定程度上能降低低溫脅迫給植物葉片帶來的損傷，延緩低溫導(dǎo)致的葉片光合損失。
4 結(jié)論
與根瘤菌共生結(jié)瘤固氮一定程度上能增加紫花苜蓿的滲透調(diào)節(jié)能力，維持光合作用水平和氧化物清除能力，從而提高紫花苜蓿對低溫脅迫環(huán)境的抵抗力，有助于提高紫花苜蓿在寒冷地區(qū)的生存能力。
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