油菜miR169基因家族的生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)

阮先樂，王俊生，劉紅占，陳良兵，趙錦慧

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001)

MicroRNA(miRNA)是動(dòng)植物體內(nèi)一種長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，它通過與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)結(jié)合，可以使mRNA降解、翻譯抑制或者使RNA介導(dǎo)的DNA甲基化，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1-5]、逆境脅迫[6-10]、胚胎發(fā)生[11-13]等方面起重要作用。miR169是植物中比較大的miRNA基因家族，目前已經(jīng)在35個(gè)物種中鑒定出400多個(gè)miR169基因[14]，這些基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用。miR169基因在擬南芥的生長(zhǎng)過程中扮演重要的角色[15-16]，擬南芥miR169a靶基因NF-YA5在抗旱方面表現(xiàn)負(fù)反饋?zhàn)饔肹17]；水稻的miR169基因與鹽脅迫和干旱誘導(dǎo)相關(guān)[18]；Calvio等[19]研究表明，miR169基因參與植物的開花調(diào)控；玉米zma-miR169/ZmNF-YA14在根伸長(zhǎng)及鹽脅迫響應(yīng)中扮演著極其重要的角色[20]；舒李露等[21]研究表明，山核桃miR169通過作用下游基因可以調(diào)節(jié)花發(fā)育；尹海龍[22]研究表明，超表達(dá)大豆miR169d基因，大豆的抗鹽堿能力增強(qiáng)，抗旱能力可能有所減弱。楊樹miR169 基因家族的靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、抗病蛋白、泛素連接酶等，說明其廣泛參與了楊樹多種生命活動(dòng)的調(diào)控[23]。

在油菜miRNA的研究方面，也取得了一些成果。李會(huì)[24]利用擬南芥F-box基因序列克隆了油菜miR394靶基因F-box的cDNA序列，同時(shí)構(gòu)建了油菜miR394a/b/c的過表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將它們分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，這些工作為研究miR394對(duì)F-box的調(diào)控作用打下了基礎(chǔ)。張蕓[25]研究表明，鎘處理能增強(qiáng)油菜根、莖、葉等不同組織中miR394a的表達(dá)，從而使靶基因F-box的表達(dá)受抑制。張柳偉[26]研究表明，miR395在保護(hù)油菜抵御鎘毒性及鎘誘導(dǎo)的氧化脅迫中發(fā)揮重要功能；黃思齊[27]研究表明，鎘脅迫和缺硫脅迫均能提高miR395的表達(dá)量；董云等[28-29]研究得到41個(gè)油菜miRNAs以及67個(gè)蕓薹屬特有的miRNAs，其中，miR169d可能通過調(diào)控靶基因NF-YA的表達(dá)參與了油菜的早花發(fā)育；陶慶[30]研究表明，miR169基因家族的成員均對(duì)150 mmol·L-1NaCl、15% PEG(體積分?jǐn)?shù))和100 μmol·L-1ABA脅迫有響應(yīng)，但是每個(gè)基因的表達(dá)模式不完全相同。

油菜是世界四大油料作物之一。我國(guó)的油菜種植面積和生產(chǎn)總量占世界第一，每年油菜可以提供700萬(wàn)t蛋白飼料和400萬(wàn)t食用油，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中起重要作用[31]。本研究以油菜為研究材料，采用生物信息學(xué)手段，對(duì)油菜miR169(bna-miR169)基因家族的序列特征、分子進(jìn)化、啟動(dòng)子和靶基因等進(jìn)行研究，為深入了解油菜miR169基因家族的功能及其在分子育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從miRBase(http://www.mirbase.org/)下載油菜(BrassicanapusL.)miR169基因家族成員的前體序列和成熟序列。

1.2 方法

1.2.1 bna-miR169基因的染色體定位分析

利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的blast程序，將bna-miR169基因前體序列作為查詢序列，在油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Ref Seq Genome Database)進(jìn)行搜索比對(duì)，確定油菜各個(gè)miR169基因在油菜基因組中的位置。

1.2.2 bna-miR169基因家族的進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0.21軟件，采用NJ法對(duì)bna-miR169基因家族的前體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，校驗(yàn)參數(shù)bootstrap重復(fù)1 000次。

1.2.3bna-miR169基因前體序列的堿基保守性分析

利用WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)分析基因前體序列的堿基保守性。

1.2.4 bna-miR169基因的啟動(dòng)子分析

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)基因上游1 500 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析。

1.2.5 bna-miR169基因的靶基因預(yù)測(cè)方法

利用psRNATarget網(wǎng)站(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis？function=1)，將bna-miR169基因的成熟序列作為查詢序列來預(yù)測(cè)其靶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 bna-miR169基因的染色體定位

從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得14個(gè)bna-miR169基因，這些基因分別分布在ChrA2、ChrA3、ChrA6、ChrA8、ChrA9、ChrC3、ChrC5、ChrC7和ChrC9共9條染色體上。從染色體上基因分布的數(shù)量來看，染色體ChrA06上分布的miR169基因最多，有6個(gè)，其他染色體上只有1個(gè)miR169基因(表1)。

2.2 bna-miR169基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖1可知，油菜bna-miR169基因家族可以分為2個(gè)小組：Class Ⅰ和Class Ⅱ，Class Ⅰ包括13個(gè)基因，Class Ⅱ只有1個(gè)基因bna-miR169e。

2.3 bna-miR169基因前體序列的堿基保守性

由圖2可知，bna-miR169基因前體序列的第47～69位是產(chǎn)生成熟序列的位置，這些位置的堿基高度保守，第48～65位堿基的保守性更高，其他位置的堿基保守性較差。

表1 bna-miR169基因家族的染色體定位Table 1 Chromosome location of bna-miR169 gene family

圖1 油菜bna-miR169基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of bna-miR169 gene family in oilseed rape

2.4 bna-miR169基因的啟動(dòng)子分析

bna-miR169基因家族上游啟動(dòng)子主要元件有13個(gè)，包括ABA響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)元件、赤霉素響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件和真菌誘導(dǎo)型響應(yīng)元件等。數(shù)量最多的是胚乳表達(dá)元件(SKn-1-motif)，其次是厭氧脅迫元件(cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction，ARE)、熱響應(yīng)元件(heat shock element，HSE)和干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)(MYB binding site involved in drought inducibility，MBS)，其他元件的數(shù)量相對(duì)較少(表2)。

2.5 bna-miR169基因家族的預(yù)測(cè)靶基因

靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，bna-miR169基因家族的靶基因一共有16個(gè)(表3)。bna-miR169a和bna-miR169b的靶基因完全相同，分別是BnaA02g16180D、BnaA07g22940D、BnaA09g44920D、BnaC02g21570D、BnaC06g33950D、BnaC08g37640D和BnaCnng68450D。這7個(gè)基因同屬于NF-YA基因家族；bna-miR169c～bna-miR169l的靶基因完全相同，為BnaA02g16180D、BnaA07g22940D、BnaA09g44920D、BnaC02g21570D、BnaC06g33950DBnaC08g37640D、BnaCnng68450D和BnaAnng31560D，這8個(gè)基因同屬于NF-YA基因家族；bna-miR169m有6個(gè)靶基因，分別屬于RAB、NF-YA、POX和AAA基因家族；bna-miR169n的靶基因有9個(gè)，均屬于NF-YA基因家族。這些靶基因的主要功能是參與早期胚胎發(fā)生、氮素營(yíng)養(yǎng)、干旱脅迫、GTP結(jié)合蛋白、光形態(tài)發(fā)生、鈣調(diào)素蛋白、花期調(diào)控和根生長(zhǎng)。

3 討論

本研究對(duì)油菜miR169基因家族成員進(jìn)行了序列分析和靶基因預(yù)測(cè)，得到了基因家族的基本特征信息。油菜的miR169基因家族有14個(gè)成員，其家族成員的前體序列在產(chǎn)生成熟miRNA的地方保守性比較高，而其他位置的保守性比較低，這種保守性有利于生物功能的正常發(fā)揮和生物進(jìn)程的正常進(jìn)行。本研究預(yù)測(cè)的油菜miR169靶基因有16個(gè)，由于植物miRNA基因的產(chǎn)生和消亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程[32]，所以，油菜miR169

圖2 油菜miR169基因家族的前體序列的堿基保守性Fig.2 Conserved nucleotide sequence of miR169 gene family precursor sequence in oilseed rape

基因家族成員將來可能會(huì)減少，也可能會(huì)增加，但在一定時(shí)期內(nèi)，油菜miR169/靶基因是一個(gè)極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，二者之間可能是一對(duì)多或多對(duì)一的調(diào)控關(guān)系。

miR169基因在染色體上成簇分布。玉米miR169e、miR169d、miR169i和miR169h在染色體4上成簇分布[20]。葡萄的miR169基因家族成員也存在成簇排列現(xiàn)象，其染色體11上有17條成簇分布序列[33]。有的成簇排列基因的間隔序列之間沒有啟動(dòng)子，這些成簇排列的基因擁有共同的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄時(shí)作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位同時(shí)轉(zhuǎn)錄[14]。本研究表明，bna-MIR169e和bna-MIR169i，bna-MIR169f、bna-MIR169j和bna-MIR169l成簇分布，但是它們的啟動(dòng)子不同，說明它們的表達(dá)受不同調(diào)控因子調(diào)控。

本研究表明，bna-miR169基因家族的靶基因大多屬于NF-YA家族，這些靶基因的上游啟動(dòng)子元件主要是SKn-1-motif、ARE、HSE和MBS。在小麥、水稻和玉米中，miR169的靶基因也是NF-YA[20，34]。miR169可以響應(yīng)非生物脅迫，同時(shí)NF-YA在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中具有十分重要的作用。NF-YA是NF-Y的一個(gè)亞基，它主要包括色氨酸和谷氨酰胺或蘇氨酸的N端、NF-YC/NF-YB結(jié)合域和1個(gè)DNA結(jié)合域[35]。后續(xù)研究可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)miR169及其靶基因的功能與關(guān)系進(jìn)行深入研究，以闡明miR169/NF-YA的調(diào)控機(jī)制，深入了解油菜對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制；同時(shí)結(jié)合miR169靶基因上游啟動(dòng)子元件分析，為今后油菜新品種選育提供一個(gè)比較好的途徑。

表2 bna-miR169基因家族主要啟動(dòng)子元件Table 2 Promoter elements of bna-miR169 gene family

表3 bna-miR169基因家族靶基因及其功能預(yù)測(cè)Table 3 Target genes and function prediction of bna-miR169 gene family

續(xù)表3