中風通脈湯調(diào)控miR-155治療急性腦梗死的作用機制研究

趙平麗，秦合偉，呂哲

(1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

急性腦梗死是臨床上最常見的缺血性心腦血管疾病之一，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)在急性腦梗死發(fā)病機制中起到重要作用[1]，微小RNA-155(miR-155)在固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮作用，參與了急性腦梗死的發(fā)生和調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，miR-155對Treg增殖具有調(diào)控作用，其異常表達與免疫穩(wěn)態(tài)異常引發(fā)的疾病相關[2]。本研究觀察中風通脈湯對miR-155調(diào)控及對調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)表達水平的影響，研究中風通脈湯治療急性腦梗死的作用機制，現(xiàn)論述如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2015年5月—2017年5月駐馬店市中醫(yī)院收治的確診為急性腦梗死的80例患者，按照隨機數(shù)字表法將80例患者分為觀察組和對照組，每組各40例，觀察組男性患者20例，女性患者20例；年齡40～69歲，平均(48.89±6.55)歲，發(fā)病時間(15.78±3.79)h；對照組40例，男性患者21例，女性患者19例；年齡41～70歲，平均(49.01±7.46)歲，發(fā)病時間(16.04±6.35)h；兩組患者在年齡、性別和發(fā)病時間等方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 西醫(yī)診斷標準

(1)西醫(yī)診斷符合中華醫(yī)學會第四次腦血管病學術會議制定的急性腦梗死診斷標準[3]；(2)患者發(fā)病時間6～72 h；(3)安靜狀態(tài)下發(fā)病，發(fā)病時多數(shù)無顯著頭痛及嘔吐，經(jīng)過頭顱MRI或者CT證實有梗死病灶，有明顯低密度改變。

1.3 中醫(yī)診斷標準

中醫(yī)證候診斷標準參照1996年國家中醫(yī)藥管理局腦病急癥科研協(xié)作組制訂的《中風病診斷療效評定標準》氣虛血瘀證,證見半身不遂，口舌歪斜，言語謇澀或不語，偏身麻木，面色蒼白，氣短乏力，口角流涎，自汗心悸，手足腫脹，舌質(zhì)暗淡，舌苔薄白或白膩，脈沉緩或沉澀[4]。

1.4 納入標準

(1)符合上述中醫(yī)診斷標準和西醫(yī)診斷標準；(2)經(jīng)倫理委員會審查通過，患者或家屬簽署知情同意書。

1.5 排除標準

(1)大面積腦梗死生命體征不穩(wěn)定者；(2)伴有嚴重的心、肝、肺、腎等原發(fā)病患者；(3)妊娠或哺乳期者；(4)不能配合本研究和治療的患者。

1.6 治療方法

對照組：采用抗凝、抗血小板、改善循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、調(diào)節(jié)血脂、清除自由基和調(diào)控血壓血糖等常規(guī)基礎療法[5]。

觀察組：在基礎治療同時服用中風通脈湯，中風通脈湯組成：黃芪30 g，黨參15 g，當歸尾10 g，赤芍15 g，紅花10 g，川芎10 g，桃仁10 g，地龍10 g，水蛭12 g，甘草 g，每付煎成2包，每包煎成150 mL，口服或鼻飼，每次150 mL，每日2次，2周為一療程。兩組均治療2周后進行療效評價。

1.7 觀察指標

(1)外周血調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)表達水平測定：采用流式細胞儀Facscalibur檢測，儀器及試劑盒購自美國BD公司，采用CellQuest Pro軟件進行分析[6]。

(2)采用熒光RT-PCR法檢測miR-155和Foxp3 mRNA水平：抽取靜脈血10 mL，肝素抗凝，采用TRIzol一步法提取總RNA，β-actin為內(nèi)參物。各基因引物序列及擴增產(chǎn)物長度：

miR-155上游引物5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG3′，下游引物5′-GCAGGGTCCGAGGT3′；Foxp3上游引物5′-CCTGGGCTCCTCGCCTCACC3′，下游引物5′-TCTCTCTGCCCCTCACC3′；β-actin，上游引物5′-GTAAAGACCTCTATGCCA3′，下游引物5′-CCTTCACCGTCCAGTTT-3′。

(3)采用ELISA法檢測血清炎性因子水平：白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)[1]。

(4)檢測血漿同型半胱氨酸(HCY)、血管性假血友病因子(VWF)和a顆粒膜蛋白-140(GMP-140)等血栓相關因子水平：清晨采集空腹靜脈血，離心分離血漿進行測定[7]。

(5)采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評定患者神經(jīng)功能[8]，采用Barthel指數(shù)(Barthel index，BI)積分法評定日常生活能力。

(6)臨床總療效：根據(jù)NIHSS評分減少百分比進行評定：①基本痊愈：91%～100%;②顯著進步：46%～90%級;③進步：18%～45%;④無效：小于17%，每組總有效率=(基本痊愈例數(shù)+顯著進步例數(shù)+進步例數(shù))/總例數(shù)[8]。

(7)并發(fā)癥監(jiān)測：治療期間檢測患者血、尿、大便常規(guī)及肝、腎功能。

1.8 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用(均數(shù)±標準差)表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 中風通脈湯對外周血Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達的影響

治療前，兩組患者Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達水平較治療前明顯降低(P<0. 05)，觀察組患者降低程度明顯大于對照組(P<0. 05),見表1。

表1 中風通脈湯對外周血Treg表達率，F(xiàn)oxP3 mRNA，miR-155 mRNA表達的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.2 中風通脈湯對血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影響

治療前，觀察組和對照組的血清IL-10、TNF-α、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者血清IL-10、TNF-α、IL-6水平較治療前均明顯降低(P<0.05)，且觀察組的降低程度大于對照組(P<0.05)。具體見表2。

表2 中風通脈湯對血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.3 中風通脈湯對Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平的影響

治療前，兩組患者間血漿Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者血漿Hcy、VWF和GMP-140水平均明顯降低(P<0.05)，且觀察組的改善程度優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 中風通脈湯對Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.4 兩組患者NIHSS積分和BI積分比較

治療前，兩組患者間NIHSS積分和BI積分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者NIHSS積分和BI積分較治療前明顯改善(P<0.05)；觀察組NIHSS評分和BI積分改善程度優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者間NIHSS積分和BI積分比較分)

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.5 兩組患者臨床總有效率比較

觀察組患者總有效率96.00%明顯優(yōu)于對照組86.00%(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者臨床總有效率比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

2.6 并發(fā)癥監(jiān)測

治療期間未發(fā)現(xiàn)血、尿、大便常規(guī)及肝、腎功能異常。

3 討論

急性腦梗死是由于腦血管閉塞引起的顱內(nèi)相應供血部位的腦組織缺血缺氧性壞死，進而引起患者肢體功能障礙，研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死與炎癥反應密切相關，血清TNF-α水平與腦梗死的面積大小成正比，IL-10和IL-6在動脈粥樣硬化和腦梗死繼發(fā)腦損傷發(fā)生中具有重要意義[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死可能處于免疫反應亢進，免疫抑制和促炎、抗炎反應的動態(tài)演變之中，急性腦梗死患者外周血Treg，F(xiàn)oxP3 mRNA表達及相關因子血清IL-10、TNF-α、IL-6水平顯著高于正常人，miR-155調(diào)控急性炎癥和Treg增殖的雙重作用，起到一定的免疫抑制作用，miR-155表達增加促使機體炎癥反應，效應性T細胞和特異性抗體的產(chǎn)生，在特異性免疫和固有免疫中起到關鍵性作用，參與了急性腦梗死的炎性反應，F(xiàn)oxP3是Treg最關鍵及特異性的轉錄因子，能夠結合在體內(nèi)miR-155的mRNA的一個內(nèi)含子上，并分泌多功能的細胞因子IL-10，其能夠抑制趨化因子及炎癥因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，是一個具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能及誘導免疫耐受的T細胞亞群，由此可見，miR-155是急性腦梗死患者免疫失調(diào)的調(diào)控網(wǎng)絡中的一個位點[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸(HCY)代謝異常能夠直接損害血管內(nèi)皮細胞功能，導致膽固醇以及脂蛋白在血管壁沉積，促進動脈粥樣硬化和血栓的形成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，血漿血管性假血友病因子(VWF)水平與血管內(nèi)皮細胞受損以及血小板黏附性密切相關，血漿a顆粒膜蛋白-140(GMP-140)是血栓前狀態(tài)和血栓形成的標志物，VWF和GMP-140均在凝血反應中起重要作用[12]。

腦梗死在中醫(yī)學中屬“中風”范疇，患者多因正氣虧虛，復因勞欲過度陰陽失調(diào)、氣血逆亂，產(chǎn)生風、火、痰、瘀，上犯于腦，腦脈痹阻，病機氣虛為本，瘀阻為標，氣血運行不利，導致腦脈痹阻，以氣虛血瘀為主要證型。中風通脈湯由補陽還五湯加減化裁而來，經(jīng)過腦病科多年的臨床實踐證實療效可靠，是本院治療急性腦梗死的主要方劑，中風通脈湯方中重用黃芪和黨參補氣，當歸尾和赤芍活血祛瘀通絡，川芎性味辛溫，能活血行氣，祛風止痛，桃仁破血祛瘀，紅花活血通經(jīng)，祛瘀止痛，地龍和水蛭破血通絡除痹，甘草調(diào)和諸藥。諸藥共奏補氣扶正、溫經(jīng)化瘀、消栓通絡之功。

本研究觀察中風通脈湯對氣虛血瘀型急性腦梗死患者的臨床療效，并研究其作用機制。結果顯示，經(jīng)中風通脈湯治療后，觀察組患者miR-155、Foxp3 mRNA表達水平和IL-10、TNF-α、IL-6水平較治療前和對照組治療后明顯降低，Hcy、VWF和GMP-140血栓相關因子水平較治療前和對照組治療后明顯降低，患者NIHSS積分和BI積分較治療前明顯改善，觀察組臨床總有效率明顯優(yōu)于對照組。研究結果表明，中風通脈湯治療氣虛血瘀型急性腦梗死，能夠改善血清炎性因子水平，降低血栓相關因子水平，減輕腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損；這可能與其通過調(diào)控miR-155，進而調(diào)節(jié)Treg增殖，降低IL-10、TNF-α、IL-6水平有關，本研究為中醫(yī)藥治療急性腦梗死患者的作用機制研究提供了一定的依據(jù)。