右歸飲調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡治療輕微腦損傷的實驗研究

王文珺鄒陽,2黃楊

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 3.臺州市立醫(yī)院

輕微腦損傷是指腦部遭受到的輕度挫傷，在兒童時期多發(fā)，通常由高處墜落、體育運動、車禍傷等引起，發(fā)病率日益增加[1]。輕微腦損傷以神經(jīng)細胞的變性和凋亡為主要特征[2]，雖然其嚴重程度輕于其他的閉合性神經(jīng)損傷，但若早期發(fā)現(xiàn)和治療不及時，仍會影響青少年的認知和平衡協(xié)調(diào)能力，對青少年的正常生長發(fā)育和社會生活造成影響[3]。輕微腦損傷給青少年患者帶來的危害性不容忽視，所以迫切需要尋找更有效、副作用小的治療方法。目前臨床上針對輕微腦損傷的主要治療手段是大量激素沖擊和藥物消腫，但存在諸多副作用[4]，總體治療效果不佳。隨著對中醫(yī)藥的研究進一步加深，發(fā)現(xiàn)中藥治療中樞神經(jīng)損傷，可以促進神經(jīng)生長因子釋放、減少神經(jīng)抑制因子的生成，且具有來源方便、毒副作用小、價格便宜等優(yōu)勢[5]。

中醫(yī)理論認為，腦為髓之海，腦髓是神志活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。大腦的輕微損傷引起的認知和運動協(xié)調(diào)能力下降，在中醫(yī)學(xué)中屬于“神志病”范疇，病因病機以腎陽虧虛為本，寒濕、痰瘀閉阻清竅為標。研究發(fā)現(xiàn)，右歸飲作為補腎溫陽的代表方，補腎益精健腦，可用于治療神經(jīng)損傷，保護腎虛模型大鼠損傷的神經(jīng)細胞，升高大鼠大腦皮質(zhì)抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比例（Bcl-2/Bax），減少神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)軸突的再生[6]。因此本實驗首次通過用右歸飲治療輕微腦損傷實驗動物模型，觀察其對神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)蛋白，以及血清炎性因子和神經(jīng)血管生長因子表達的影響，明確右歸飲的作用機制,為中醫(yī)藥治療神經(jīng)損傷提供更多的理論依據(jù)以及新的路徑。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 右歸飲由熟地黃9g、山茱萸3g、山藥6g、制附子9g、肉桂3g、枸杞6g、姜杜仲6g和炙甘草3g組成[7]，將藥物濃縮、干燥碾細后，得到右歸飲細粉。以上藥物購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館，方藥制備于浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥制劑室。實驗時將右歸飲細粉用0.9%氯化鈉溶液溶解至每毫升含生藥0.69g備用。ELISA試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司（批號：20170601）；RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司（批號：AK1401）；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）購自 TaKaRa公司（批號：AK5101）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自 TaKaRa公司（批號：AKA1201）；抗 caspase-3抗體購自北京博奧森公司（批號：AG04266808）；抗Bax抗體購自北京博奧森公司（批號：AG05085355）；抗Bcl-2抗體購自北京博奧森公司（批號：AG04279476）；抗細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）抗體購自北京博奧森公司（批號：AF07044415）；熒光羊抗兔抗體購自美國LI-COR公司（批號：C51104-08）；超敏酶標山羊抗兔抗體購自北京中杉生物技術(shù)公司（批號：107257D9）。

1.2 實驗動物 清潔級SD大鼠 48只，雌雄各半，4周齡，實驗初始體質(zhì)量85～90g，購自中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司 [動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬）2012-0002]。動物飼養(yǎng)和實驗均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進行[動物使用許可證號：SYXK(浙）2013-0184]。

1.3 主要儀器 Nikon Eclipse 80i顯微鏡購自日本Nikon公司；Carl Zeiss Imaging Systems軟件購自德國Carl Zeiss公司；HM335E切片機、AP280-2包埋機購自德國 MICROM公司；Mini Electrophoresis System電泳系統(tǒng)購自美國Bio-RAD公司；DRP-9052型電熱恒溫箱購自上海森信實驗儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物造模與分組給藥 將48只SD大鼠按隨機數(shù)字表分為3組，每組16只，分別為空白對照組、模型組、右歸飲治療組。各組大鼠飼養(yǎng)條件相同，自由攝食和飲水。按照Mychasiuk等[8]提出的自由落體法造模：將右歸飲治療組、模型組大鼠置于麻醉機中，吸入濃度為1%～2%的異氟烷約3min。當大鼠足趾反射消失確認為輕度麻醉后，將大鼠從麻醉機中取出，俯臥位置于鋁箔紙平臺上，平臺下方放置海綿墊保護。另將1枚150g的砝碼通過尼龍線與鐵架臺固定后，置于1根直徑2cm、長1.5m的柱狀聚乙烯管中。將聚乙烯管置于大鼠頭部上方，并用插銷將砝碼固定在大鼠頭部中心上方0.5m處。將插銷撤去后，砝碼自由落下直接砸中錫箔紙平臺上的大鼠頭部正中央，大鼠跌落到海綿墊上，而尼龍線可將砝碼固定在海綿墊上方，不至于繼續(xù)下落產(chǎn)生二次傷害。該造模法持續(xù)3d，撞擊1次/d?？瞻讓φ战M大鼠不作任何處理。3d撞擊結(jié)束后，經(jīng)過行為學(xué)測試分析[1]，確定造模成功，分別對各組大鼠給藥，經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算后[9]，右歸飲治療組以10g/kg的劑量行右歸飲灌胃治療，模型組和空白對照組大鼠同時予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。均為1次/d，持續(xù)灌胃4周。

1.4.2 取材 灌胃4周后，所有大鼠均以2%戊巴比妥（0.3mL/100g）腹腔麻醉，心臟取血，離心分離血清后，-20℃保存。每組選擇8只大鼠，取出大腦，予石蠟包埋后，行HE染色和免疫組化檢測。每組余下8只大鼠處死后立即取出大腦，分離海馬組織，于-80℃中保存，進行Western blot和QPCR檢測。

1.4.3 觀察指標

1.4.3.1 血清中細胞因子表達的檢測 ELISA法檢測大鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelia factor，VEGF）和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）的表達量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4.3.2 HE染色觀察海馬組織病理學(xué)變化 大鼠腦組織石蠟包埋后，行冠狀位5μm切片，烘干后以二甲苯脫蠟。切片經(jīng)過乙醇和蒸餾水浸泡后，依次放入蘇木精（Hematoxylin，H)和伊紅（Eosin，E)染色液中進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理學(xué)變化。

1.4.3.3 Western blot檢測大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的表達 在海馬組織標本中加入裂解液，4℃下裂解30min，BCA法計算樣品蛋白濃度后，將裂解后的蛋白提取物上樣于SDS聚丙烯酰胺凝膠上，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1h。封閉結(jié)束后，在4℃下分別加入caspase-3（1:100）、Bcl-2（1:100）、Bax（1:500）、Cyt C（1:100）一抗，孵育過夜。次日加入二抗（1:10000）在室溫下繼續(xù)孵育2h。二抗孵育完成后進行ECL曝光顯影。并且用Image J軟件對曝光顯影后的條帶掃描后進行灰度分析，計算出目的條帶和內(nèi)參條帶的平均光密度值。

1.4.3.4 免疫組化檢測大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的表達 將石蠟切片脫蠟、洗滌，經(jīng)高壓熱修復(fù)后，在3%H2O2溶液中浸潤10min，阻斷過氧化物酶。取出切片，以PBS溶液反復(fù)洗滌3次。向切片中分別滴加caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyt C 一抗（1:100），37℃孵育60min。PBS洗滌切片后向切片中滴加二抗（1:1），37℃中孵育60min，最后用DAB染色液進行顯色，復(fù)染、透明后封片。用Nikon eclipse 80i顯微鏡200倍鏡下觀察，每張切片隨機選取3個視野，利用Carl Zeiss Imaging Systems軟件進行圖像分析，計算出累積光密度（integrated opticdensity,IOD）和陽性指數(shù)，陽性指數(shù)為IOD與圖像分辨率的比值。

1.4.3.5 QPCR檢測大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)基因mRNA的表達 按照TaKaRa RNAiso Plus(Total RNA提取試劑）說明書提取大鼠海馬組織總RNA，并且進行逆轉(zhuǎn)錄，條件如下：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃ 15min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)85℃ 5s，最終為4℃。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計，見表1。操作按照TaKaRa熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行，cDNA擴增條件如下：預(yù)變性 95℃ 3min；95℃ 10s，60℃ 30s，共 48 個循環(huán)；熔解曲線從 55℃開始，每30s升高0.5℃，直到95℃，1個循環(huán)。所有反應(yīng)信息資料由StepOne Plus PCR儀收集，計算機軟件測量并計算Ct值，mRNA相對表達量通過公式2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；方差分析后作兩兩比較的q檢驗，檢驗組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清炎性因子表達比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中的炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而VEGF和NGF的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。右歸飲治療組大鼠血清中 IL-1β、TNF-α、iNOS表達量明顯低于模型組，但高于空白對照組；而VEGF和NGF的表達量則明顯高于模型組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.2 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達比較與空白對照組比較，模型組中凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C的表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。右歸飲治療組中凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C的表達量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），其中 Bax、Cyt C表達量高于空白對照組（P＜0.01）；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量高于模型組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

表2 各組大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS、VEGF 及 NGF 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β,TNF-α,iNOS,VEGF and NGF of each group（±s）

表2 各組大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS、VEGF 及 NGF 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β,TNF-α,iNOS,VEGF and NGF of each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01.

組 別 n I L-1 β(p g·m L-1) T N F-α(p g·m L-1) i N O S(U·m L-1) V E G F(p g·m L-1) N G F(p g·m L-1)模型組右歸飲治療組空白對照組155.04±21.38247.03±19.43**##135.09±16.3716161625.56±3.02**20.85±1.42**##11.98±1.51209.44±28.38**169.85±11.46**##89.87±13.549.40±0.77**7.73±0.58**##5.15±0.66118.75±15.71184.16±19.81**##103.60±12.93

圖1 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.1 The expression of apoptosis related protein in hippocampus of each group

表3 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of apoptosis related protein in hippocampus of each group（±s）

表3 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達比較（±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of apoptosis related protein in hippocampus of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

組別 n c a s p a s e-3/G A P D H B c l-2/G A P D H B a x/G A P D H C y t C/G A P D H模型組右歸飲治療組空白對照組0.50±0.02**0.41±0.03**#0.25±0.088 8 80.57±0.07**0.30±0.07##0.25±0.081.32±0.121.58±0.04*#1.32±0.201.73±0.05*1.53±0.05**#1.32±0.20

2.3 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化 HE染色后鏡下觀察提示，空白對照組大鼠海馬組織邊緣清晰，細胞排列均勻，細胞外基質(zhì)呈粉紅色，細胞核為橢圓形，呈深藍色。模型組大鼠海馬中神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞數(shù)目稀少，細胞邊緣模糊，伴有核碎裂。而右歸飲治療組中的海馬組織邊緣欠清晰，細胞排列尚均勻，細胞數(shù)量較模型組多。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化（HE染色，20×）Fig.2 Pathological changes of HE staining in hippocampus of each group(HE stain,20×)

2.4 各組大鼠海馬組織中的凋亡相關(guān)蛋白表達比較模型組中凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt C表達陽性指數(shù)高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2的陽性指數(shù)低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；右歸飲治療組中caspase-3、Bax和Cyt C表達陽性指數(shù)低于模型組，高于空白對照組；Bcl-2的陽性指數(shù)高于模型組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖3-6、表4。

圖3 各組大鼠海馬組織中Bax表達比較（20×）Fig.3 Expression of Bax protein in hippocampus tissues of each group(20×)

圖4 各組大鼠海馬組織中caspase-3表達比較（20×）Fig.4 Expression of caspase-3 protein in hippocampus tissues of each group(20×)

圖5 各組大鼠海馬組織中Cyt C表達比較（20×）Fig.5 Expression of Cyt C protein in hippocampus tissues of each group(20×)

圖6 各組大鼠海馬組織中Bcl-2表達比較（20×）Fig.6 Expression of Bcl-2 protein in hippocampus tissues of each group(20×)

表4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達的陽性指數(shù)（±s）Tab.4 Comparison of the expression levels of apoptotic related positive indexes in hippocampus tissues of each group（±s）

表4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達的陽性指數(shù)（±s）Tab.4 Comparison of the expression levels of apoptotic related positive indexes in hippocampus tissues of each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別 n c a s p a s e-3 B c l-2 B a x C y t C模型組右歸飲治療組空白對照組0.02±0.00**0.01±0.00**##0.00±0.008 8 80.03±0.00**0.02±0.01**#0.01±0.000.02±0.010.19±0.03**##0.03±0.010.18±0.11**0.05±0.01#0.01±0.02

2.5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)基因mRNA表達比較 模型組中凋亡基因caspase-3、Bax和Cyt C mRNA相對表達量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），抗凋亡基因 Bcl-2 mRNA 相對表達量也高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。右歸飲治療組中的凋亡基因caspase-3、Bax和Cyt C的mRNA相對表達量較模型組下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），而Cyt C mRNA相對表達量高于空白對照組（P＜0.01）；抗凋亡基因Bcl-2的mRNA相對表達量較其余兩組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)基因mRNA的表達比較（±s）Tab.5 Comparison of the expression levels of apoptotic related gene in hippocampus tissues of each group（±s）

表5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)基因mRNA的表達比較（±s）Tab.5 Comparison of the expression levels of apoptotic related gene in hippocampus tissues of each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

組別 n c a s p a s e-3 B c l-2 B a x C y t C模型組右歸飲治療組空白對照組1.58±0.14**1.26±0.07**##0.96±0.138 8 81.48±0.28**1.05±0.20#1.00±0.081.26±0.251.85±0.52*#1.03±0.261.41±0.29*1.05±0.10#1.00±0.09

3 討論

輕微腦損傷的嚴重程度較其他的閉合性神經(jīng)損傷要輕，因此臨床上容易忽視，而且目前西醫(yī)缺乏有效的治療手段，總體治療效果欠佳。神經(jīng)損傷的主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞凋亡，即由某些體內(nèi)外的因素觸發(fā)和啟動的細胞程序性死亡。在神經(jīng)損傷和腦缺血的局灶中的研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，炎性因子 IL-1β、TNF-α、iNOS 表達顯著升高，激活小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），進一步加劇炎性反應(yīng)[13-14]，同時促進死亡受體家族自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）、自殺相關(guān)因子配體（factor associated suicide ligand，F(xiàn)asL）、腫瘤壞死因子受體 1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）基因的轉(zhuǎn)錄，并促進線粒體釋放Cyt C等蛋白，激活caspase基因，上調(diào)與凋亡密切相關(guān)的水解酶caspase-3、caspase-9的活性[15-16]，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種死亡受體介導(dǎo)凋亡途徑的共同下游部分和凋亡相關(guān)酶聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。而Bcl-2蛋白家族則是重要的凋亡調(diào)控因子，Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w可以抑制Cyt C從線粒體中釋放，下調(diào)caspase-3的活性，抑制細胞凋亡；相反，Bax、Bak等蛋白則可促進Cyt C釋放，促進凋亡[17-19]。因此抑制神經(jīng)元的凋亡是治療神經(jīng)損傷的嶄新思路。

輕微腦損傷在中醫(yī)學(xué)中屬于“神志病”范疇，因腎主志，生髓通腦，故治療時宜強調(diào)溫陽補腎、填精益髓。近年來在臨床上通過使用人參、川芎、黃芪、當歸等單味中藥，以及補陽還五湯配合針灸療法等治療神經(jīng)損傷，促進神經(jīng)修復(fù)，取得了不錯的治療效果[20]。右歸飲作為補腎溫陽的代表方，方中附子和肉桂兩藥并用，培補腎中元陽、溫里祛寒，是為君藥；熟地黃、山茱萸、山藥滋陰益腎、養(yǎng)肝補脾、填精益髓，取“陰中求陽”之義，是為臣藥；杜仲補肝腎、強筋骨，為佐藥。諸藥合用，以溫腎陽為主，而陰陽兼顧，肝脾腎并補。本實驗發(fā)現(xiàn)，輕微腦損傷大鼠在右歸飲治療后，免疫組化、Western blot和QPCR檢測的海馬組織中 caspase-3、Cyt C、Bax等凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達量較模型組明顯下調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調(diào)，而右歸飲治療組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、iNOS表達量顯著降低，血管和神經(jīng)生長因子VEGF、NGF表達量升高。結(jié)合前期研究結(jié)果[21]，說明右歸飲用于輕微腦損傷大鼠的治療，能夠緩解大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)，減少線粒體中的Cyt C釋放，從而抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達，減輕神經(jīng)細胞的損傷，并且增加VEGF、NGF等因子的釋放，促進神經(jīng)和血管的再生。與臨床上針對輕微腦損傷的激素沖擊、脫水消腫等常用治療手段比較，右歸飲可以有效促進神經(jīng)再生、抑制神經(jīng)凋亡、保護神經(jīng)元存活，而且副反應(yīng)較輕，還具有來源廣泛、價格便宜等優(yōu)勢，患者可長期服用。

因此，根據(jù)中醫(yī)“腎生髓通腦”理論，本研究首次發(fā)現(xiàn)，補腎中藥右歸飲在輕微腦損傷中可以發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的作用，降低炎癥反應(yīng)，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而保護神經(jīng)。但是，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡及神經(jīng)修復(fù)和再生的機制十分復(fù)雜，補腎中藥治療神經(jīng)損傷疾病的機制和效果仍需要更多的研究。