低聚半乳糖對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

劉廣芹，涂玉蓉，江耀倫，李美娣，易永萍，陳素珍，溫 馨，武 力

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣州華農(nóng)大實(shí)驗(yàn)獸藥有限公司，廣東廣州 510642)

功能性低聚糖作為無殘留、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒無害無副作用的綠色添加劑，對(duì)動(dòng)物機(jī)體腸道菌群調(diào)節(jié)作用效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖能夠促進(jìn)腸道有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)[1-3]。目前已研究發(fā)現(xiàn)的功能性低聚糖有20多種，主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖等[4]。低聚半乳糖是已被開發(fā)的唯一源自動(dòng)物乳汁的低聚糖[5],其安全度高，食療效果明顯，對(duì)人體健康有益，已獲得廣泛認(rèn)可。本研究主要分析低聚半乳糖在體內(nèi)外對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為低聚半乳糖在臨床上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸埃希菌O78(CVCC1569)、嗜酸乳桿菌，廣州華農(nóng)大實(shí)驗(yàn)獸藥有限公司研發(fā)中心保存菌種。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c雄性小鼠50 只，6周齡～8 周齡，體重18 g～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)2013—0002。

1.1.3 試劑 70%低聚半乳糖粉，云浮市新金山生物科技有限公司產(chǎn)品；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基TSC培養(yǎng)基、D-環(huán)絲氨酸、革蘭染色液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 體外試驗(yàn) 用20、30、40 g/L的低聚半乳糖處理培養(yǎng)基，含葡萄糖培養(yǎng)基為對(duì)照組。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[6]對(duì)大腸埃希菌和乳酸桿菌進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)，觀察不同添加量低聚半乳糖對(duì)大腸埃希菌和乳酸桿菌生長(zhǎng)的影響。

分別取含有20、30、40 g/L的低聚半乳糖的LB肉湯培養(yǎng)基200 μL于96孔板內(nèi)，然后接種稀釋10-7倍大腸埃希菌菌液100 μL，每組3個(gè)平行，置36℃±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每隔3 h測(cè)定630 nm的吸光度，連續(xù)測(cè)定24 h并繪制生長(zhǎng)曲線。相同方法，將乳酸桿菌稀釋10-8倍，厭氧培養(yǎng)測(cè)定乳酸桿菌630 nm的吸光度。

1.2.2 體內(nèi)試驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003》[7]中調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢測(cè)方法，試驗(yàn)分別設(shè)人體推薦劑量的5、10、30倍作為試驗(yàn)劑量，設(shè)立對(duì)照組。具體處理見表1。

稱取各組小鼠體重取平均值，并分別將含量為70%的低聚半乳糖根據(jù)上表中的劑量進(jìn)行相應(yīng)受試物的配制，受試藥物用無菌蒸餾水配制，滅菌，分裝，不同劑量組試樣4℃冷藏保存。在第0、7、14天無菌壓迫法定量采集小鼠新鮮糞便，處理后進(jìn)行菌群培養(yǎng)和鑒定，對(duì)大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)菌落在30～300之間的平板，計(jì)算出每克糞便中的活菌數(shù)(CFU/g)，換算成以10為底的對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析(One-Way ANVOA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，均值采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

表1 低聚半乳糖體外試驗(yàn)分組及處理

注：每組每日清晨一次經(jīng)口灌胃0.2 mL ，連續(xù)灌胃14 d。對(duì)照組灌胃無菌蒸餾水。

Note: Each group was orally administered 0.2 mL once daily in the morning and continued for 14 days.The control group was given sterile distilled water.

2 結(jié)果

2.1 低聚半乳糖對(duì)大腸埃希菌和乳酸桿菌的影響

按照20、30、40 g/L劑量添加低聚半乳糖，大腸埃希菌菌落數(shù)分別為3.70×108、1.96×108、2.4×108CFU/mL，乳酸桿菌菌落數(shù)分別為4.73×109、4.20×109、3.80×109CFU/mL。其中30 g/L組和40 g/L組大腸埃希菌菌落數(shù)與對(duì)照組3.2×108CFU/mL相比差異顯著 (P<0.05)，乳酸菌各組與對(duì)照組3.27×109CFU/mL相比落數(shù)均有不同程度的增長(zhǎng)(P<0.05)，由此可以看出，體外添加一定濃度的低聚半乳糖對(duì)大腸埃希菌增殖具有一定的抑制作用，當(dāng)添加量為30 g/L時(shí)效果最明顯；體外添加一定濃度低聚半乳糖對(duì)均能促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)(圖1和圖2)。

2.2 低聚半乳糖對(duì)大腸埃希菌和乳酸桿菌OD值的影響

由圖3可知，大腸埃希菌可以利用低聚半乳糖，轉(zhuǎn)接后的6 h內(nèi)大腸埃希菌的生長(zhǎng)比較緩慢，在6 h～9 h內(nèi)大腸埃希菌生長(zhǎng)速度，在16 h開始菌體濃度趨于穩(wěn)定，此時(shí)30 g/L濃度的低聚半乳糖組大腸埃希菌的濃度最低。由圖4可知，乳酸桿菌可以利用低聚半乳糖，轉(zhuǎn)接后的15 h內(nèi)乳酸菌的生長(zhǎng)比較緩慢，在15 h～30 h內(nèi)乳酸菌生長(zhǎng)速度，在36 h開始菌體濃度趨于穩(wěn)定，此時(shí)30 g/L半乳糖組乳酸桿菌濃度最高。

圖1 低聚半乳糖對(duì)大腸埃希菌體外增殖效果

圖2 低聚半乳糖對(duì)乳酸桿菌體外增殖效果

2.3 低聚半乳糖對(duì)小鼠糞便中大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的作用

用低聚半乳糖對(duì)小鼠進(jìn)行14 d灌胃飼養(yǎng)，結(jié)果顯示，灌胃第7天與灌胃前比較，低、中、高劑量組大腸埃希菌數(shù)量均明顯減少(P<0.05)，灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組大腸埃希菌數(shù)量分別為5.22、5.25、5.52 log CFU/g,表明低聚半乳糖可抑制小鼠體內(nèi)大腸埃希菌的增殖，本試驗(yàn)中灌胃第7天低聚半乳糖各劑量組對(duì)大腸埃希菌增殖有不同程度抑制作用，其中低聚半乳糖中低劑量組對(duì)大腸埃希菌的抑制效果最明顯(圖5)。

用低聚半乳糖灌胃小鼠第7天和第14天，低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量比對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別為4.85、5.13、5.08 logCFU/g；灌胃第14天低聚半乳糖低、中、高劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別為4.80、5.05、5.09 logCFU/g；從灌胃7天和14天的數(shù)據(jù)得出灌胃7 d～14 d內(nèi),小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定(圖6)。

灌胃第7天時(shí)低聚半乳糖低劑量組和高劑量組乳酸桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，灌胃第14天低、中劑量組乳酸桿菌數(shù)量增加，但低劑量組灌胃14天乳酸菌數(shù)量比灌胃第7天減少，高劑量組灌胃14 d與灌胃第0、7天比較乳酸桿菌減少，均具有顯著差異(P<0.05)。灌胃第7天低聚半乳糖低、中、高劑量組乳酸桿菌數(shù)量分別為8.82、8.34、8.62 logCFU/g；由此可知，低聚半乳糖在一定的濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)乳酸桿菌的增殖(圖7)。

圖3 大腸埃希菌的生長(zhǎng)曲線

圖4 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線

圖5 低聚半乳糖對(duì)小鼠腸道大腸埃希菌的影響

圖6 低聚半乳糖對(duì)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響

圖7 低聚半乳糖對(duì)小鼠腸道乳酸桿菌的影響

3 討論

動(dòng)物機(jī)體健康的腸道菌群環(huán)境參與動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、營養(yǎng)吸收、免疫等過程，為機(jī)體健康構(gòu)建一道防御屏障[8]。腸道疾病的發(fā)生受飼料、水源、環(huán)境衛(wèi)生、溫度、濕度、動(dòng)物自身免疫力等多種因素影響。腸道中繁雜的微生物在機(jī)體健康狀態(tài)下互相依存、互相制約構(gòu)建菌群平衡，其中最主要的有益菌乳酸桿菌對(duì)腸道健康起到重要調(diào)節(jié)作用。De Angelis M等[9]發(fā)現(xiàn)，仔豬飼喂乳酸菌腸道內(nèi)大腸埃希菌數(shù)量下降，腹瀉得到改善，因此提高動(dòng)物腸道有益菌數(shù)量，減少有害菌是保證腸道健康的重要途徑。Roberfroid M等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖能夠增加乳酸菌的數(shù)量，減少有害菌，該研究結(jié)果與本研究低聚半乳糖對(duì)小鼠腸道菌調(diào)節(jié)作用結(jié)果相一致。

本研究中在體外試驗(yàn)下低聚半乳糖在30 g/L濃度下顯著抑制了大腸埃希菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)了乳酸桿菌的生長(zhǎng)。在小鼠腸道體內(nèi)試驗(yàn)中，低聚半乳糖在灌胃第7天明顯抑制了大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，有效促進(jìn)了乳酸桿菌的增殖，與本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Blaut M等[11]、Alliet P等[12]對(duì)功能性低聚糖能夠抑制有害菌促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致。

本研究低聚半乳糖在體外可以抑制大腸埃希菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)乳酸桿菌生長(zhǎng)，結(jié)合低聚半乳糖體外對(duì)大腸埃希菌的抑制和對(duì)乳酸桿菌的促進(jìn)作用，以及臨床應(yīng)用的成本得出最佳濃度為30 g/L。

體內(nèi)試驗(yàn)中低聚半乳糖在小鼠腸道內(nèi)促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，抑制大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。體內(nèi)試驗(yàn)中低聚半乳糖和低聚果糖對(duì)大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌的作用受低聚糖的劑量和灌胃時(shí)間影響，本研究中灌胃第7天低劑量組低聚半乳糖對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用最佳，灌胃14 d時(shí)大腸埃希菌和乳酸桿菌增減不一。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003》中腸道菌群測(cè)定中的判定標(biāo)準(zhǔn)，灌胃7 d小鼠糞便中乳桿菌的數(shù)量增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量減少且大腸埃希菌的數(shù)量減少，表明低聚半乳糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用。