羅布麻中黃酮的超臨界CO2萃取及其抗菌性

高世會， 郁崇文

(1. 遼寧輕工職業(yè)學(xué)院， 遼寧 大連 116100； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620)

自然界中大部分綠色植物中都含有黃酮，其含量很高，結(jié)構(gòu)由3部分組成，可用C6—C3—C6表示，即由1個中央三碳鏈C3連接2個苯環(huán)，組成黃酮的基本分子結(jié)構(gòu)。這個C3橋連部分可以直線形式與2個苯環(huán)相連，也可與其中的1個苯環(huán)和氧結(jié)合成為復(fù)雜的雜環(huán)。根據(jù)中央三碳鏈的結(jié)構(gòu)，可將黃酮類化合物分為黃酮類、異黃酮、黃酮醇類以及各類二氫衍生物[1]。另外2個苯環(huán)上一般都有取代基，不同的取代基可形成不同種類的黃酮類化合物，賦予其不同的功能，對生物的藥理作用主要表現(xiàn)在：可預(yù)防氧化[2]，延緩疲勞和衰老[3]；對循環(huán)系統(tǒng)疾病[4]和癌癥腫瘤[5]有一定治療作用；在日常生活中還可用于抗菌等[6-7]。

黃酮在羅布麻韌皮中也有較高的含量，但在傳統(tǒng)的脫膠工藝中：天然水漚麻脫膠不徹底，周期長；化學(xué)法脫膠易損傷纖維性能和光澤，且污染環(huán)境；微生物脫膠質(zhì)量不穩(wěn)定。此外在這些脫膠方法中，羅布麻韌皮中黃酮資源并沒有得到充分的利用[8-9]，其黃酮類物質(zhì)大都隨著脫膠產(chǎn)物排放到脫膠廢液中，浪費了寶貴的黃酮資源。為此，本文利用超臨界CO2對羅布麻韌皮中的黃酮進(jìn)行提取，并對羅布麻原麻、超臨界萃取黃酮后的羅布麻以及提取的黃酮進(jìn)行了液相色譜分離與檢測，進(jìn)而測定了羅布麻及其萃取液的抗菌活性，分析羅布麻纖維的抗菌機(jī)制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：當(dāng)年生長的新疆羅布麻，通過手工剝離韌皮部分(纖維素含量為 42%～48%)，羅布麻纖維采用傳統(tǒng)化學(xué)方法脫膠，殘膠率為4%～6%。

試劑：乙醇(CH3CH2OH)、甲醇(CH3OH)、磷酸(H3PO4)、三氯化鋁(AlCl3)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁(C27H30O16)、槲皮素(C15H10O7)， 中國藥品生物制品檢定所；山柰酚(C15H10O6)， 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；二氧化碳(純度99.99%)，中昊光明化工研究設(shè)計院有限公司；去離子水，實驗室自制。

儀器：超臨界CO2萃取反應(yīng)設(shè)備，大連工業(yè)大學(xué)；UV-8000型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；AL204型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EC2003型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 羅布麻黃酮乙醇提取工藝

利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液對羅布麻黃酮進(jìn)行提取。首先精確稱量羅布麻韌皮、羅布麻纖維及超臨界CO2萃取黃酮后的羅布麻纖維各30.00 g，分別裝入1 000 mL的三口燒瓶A1～A3中，然后加入900 mL乙醇溶液進(jìn)行浸泡。70 ℃回流提取 2 h，負(fù)壓抽濾萃取液。重復(fù)上述提取工藝3次并合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其萃取液的體積濃縮為原來的1/3，備用。

1.3 超臨界CO2萃取羅布麻黃酮工藝

稱取一定量的羅布麻韌皮纖維，放置于超臨界CO2流體萃取反應(yīng)裝置的反應(yīng)釜(500 mL)內(nèi)。冷凝的CO2經(jīng)預(yù)熱器升溫到臨界溫度以上，經(jīng)高壓泵升壓到臨界壓力以上，超臨界CO2流體開始對羅布麻韌皮中的黃酮進(jìn)行萃取。然后繼續(xù)升溫升壓，達(dá)到工藝要求溫度和壓力時開始計時，萃取結(jié)束后，緩緩打開反應(yīng)釜底部的閥門開始降壓，當(dāng)反應(yīng)釜內(nèi)的壓力為零時，取出反應(yīng)釜內(nèi)的羅布麻和分離釜中的萃取液備用。在超臨界CO2流體萃取羅布麻黃酮過程中，可通過背壓閥調(diào)整控制系統(tǒng)壓力。

1.4 總黃酮含量的測定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將精密稱取的干燥至恒態(tài)質(zhì)量的蘆丁0.01 g放置于100 mL的容量瓶A1中，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容，分別將1、2、3、4、5、6 mL的蘆丁溶液放置于A2～A7容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的AlCl3溶液定容至100 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液，靜置一段時間備用。用紫外-可見分光光度計，以415 nm條件下測定的蘆丁的吸光度x作為橫坐標(biāo)，以蘆丁質(zhì)量濃度y(mg/mL)作為縱坐標(biāo)，繪制吸光度曲線，得到回歸方程：

y=40.419x-0.847 2

2)萃取液中黃酮含量的測定：將黃酮萃取液放置于25 mL的容量瓶A8中定容，將其稀釋后測試吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮的質(zhì)量濃度，然后代入下式計算黃酮萃取率：

式中：E為黃酮萃取率，%；V為定容時黃酮萃取液的體積，mL；m為羅布麻韌皮質(zhì)量，mg。

1.5 黃酮成分的分離檢測

根據(jù)高效液相色譜法(HPLC)，采用SD-C18型色譜柱, 流動相A為甲醇溶液，流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的磷酸溶液，二者體積比為 50∶50，進(jìn)樣量為10 μL/次，在柱溫為30 ℃，流速為 1.0 mL/min的條件下，以360 nm波長進(jìn)行檢測。此時黃酮各成分能被檢測器所檢測，并且理論塔板數(shù)均不低于3 000。

1.6 抗菌性測試

以葡萄球菌和大腸桿菌為測試菌種，依據(jù) GB/T 20944—2008《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分：振蕩法》對羅布麻韌皮纖維抗菌性進(jìn)行測試。具體步驟為：將羅布麻萃取液加入到A1～A3三口燒瓶中，A4～A6加入對照樣，A7～A9不加試樣作為空白對照；分別加入磷酸鹽緩沖溶液和實驗室保存的3～10代待測菌種，在24 ℃、150 r/min條件下，振蕩18 h。然后利用分光光度計法測試活菌濃度。

抗菌性的計算公式為

(3)

式中：Y為試樣的抑菌率，%；Qt和Wt分別為A1～A3和A4～A6活菌濃度平均值，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 超臨界CO2萃取黃酮影響因素

羅布麻韌皮纖維經(jīng)多次乙醇提取，直至黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)不再發(fā)生變化，其值為0.92%，故可認(rèn)為此為該批羅布麻韌皮纖維的黃酮含量。

2.1.1助溶劑流量與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系

在50 ℃、20 MPa、CO2流量為 30 g/min條件下，以70%乙醇水溶液為助溶劑，研究分析助溶劑流量對羅布麻黃酮萃取的影響，選擇助溶劑流量分別為0.3、0.6、0.9 g/min，結(jié)果如圖1所示。

圖1 助溶劑流量與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系Fig.1 Relationship between content of cosolvent and extraction of flavonoids from apocynum venetum

由圖1可以看出，羅布麻黃酮萃取率隨著超臨界CO2流體中乙醇溶液的增加而提高。當(dāng)乙醇溶液流量為0.3 g/min，120 min時黃酮萃取率為0.196%；當(dāng)乙醇溶液流量增加1倍時，120 min時黃酮的萃取率提高了71.9%。這是因為CO2是非極性分子，超臨界CO2的極性會隨著助溶劑乙醇溶液增加而不斷增強(qiáng)，而極性的增強(qiáng)又會增大黃酮在超臨界流體中的溶解度，從而提高黃酮萃取率。另一個原因是，超臨界的水會破壞黃酮分子和羅布麻纖維分子之間的作用力，使黃酮分子更易從羅布麻纖維分子中脫離出來，從而提高黃酮萃取率。

當(dāng)乙醇溶液流量增大到0.9 g/min時，與 0.6 g/min相比，乙醇溶液的輸入量增加了50%，然而萃取率卻僅提高了8.9%，且在萃取過程中還出現(xiàn)了壓力不穩(wěn)的現(xiàn)象。這是因為助溶劑含量過大，使水分過多，就會使超臨界萃取系統(tǒng)中出現(xiàn)兩相結(jié)構(gòu)，即超臨界CO2流體和液體水。當(dāng)黃酮隨超臨界CO2在分離釜中分離時，由于壓力下降造成水在萃取管路中的堵塞，甚至結(jié)冰使萃取系統(tǒng)形成了斷路[10]，使反應(yīng)釜中的壓力不斷上升，影響了萃取效果，并且對設(shè)備還有一定的危害。另外超臨界流體流動性要高于液體流動性2個數(shù)量級，才具有更好的傳質(zhì)擴(kuò)散性能?；谝陨显颍x擇助溶劑流量為0.6 g/min進(jìn)行以下實驗。

2.1.2溫度與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系

在20 MPa、CO2流量為 30 g/min的條件下，分析溫度與黃酮萃取的關(guān)系，選擇溫度為40～60 ℃，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系Fig.2 Relationship between temperature and extraction of flavonoids from apocynum venetum

從圖2可以看出：在低溫階段，隨溫度升高黃酮萃取率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢；當(dāng)萃取時間為 120 min時，40 ℃黃酮萃取率為0.296%，溫度升高到 45 ℃，黃酮的萃取率提高了22.3%，達(dá)到了0.362%。這是因為溫度對超臨界黃酮萃取具有 2方面的影響：一是溫度升高，CO2密度降低，萃取效果下降；二是溫度升高，CO2黏度會降低，萃取效果提高。 40 ℃時超臨界CO2密度為839.81 kg/m3，黏度為78.322 μPa·s，溫度升高到45 ℃，其密度和黏度分別為812.69 kg/m3、73.364 μPa·s，分別下降了3.2%和6.3%。并且隨著溫度的升高，黃酮的蒸汽壓也隨之增加，這說明在此溫度范圍內(nèi)，相比于密度對黃酮萃取的影響，黏度和蒸汽壓對黃酮萃取的影響更大。在60 ℃萃取時，黃酮的萃取率下降了19.5%。這說明在高溫階段，溫度升高，超臨界CO2分子間距離增大對羅布麻黃酮萃取的影響要大于超臨界CO2分子間的黏度降低對萃取的影響[11]，所以溫度升高，黃酮萃取率反而下降。

2.1.3壓力與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系

在50 ℃、CO2流量為 30 g/min條件下，分析壓力對黃酮萃取的影響，選擇壓力范圍為10～30 MPa，結(jié)果如圖3所示。

圖3 壓力與羅布麻黃酮提取的關(guān)系Fig.3 Relationship between pressure and extraction of flavonoids from apocynum venetum

壓力從2個方面影響著羅布麻黃酮的超臨界萃取率：一是隨著壓力的增大，超臨界CO2分子之間的距離就會減小，可溶解的黃酮分子增加，有研究[12-14]顯示超臨界CO2密度與溶質(zhì)溶解度呈對數(shù)線性關(guān)系；二是壓力升高又會增大超臨界CO2分子之間的相互作用，降低黃酮在超臨界CO2中的傳質(zhì)過程，從而降低黃酮萃取率[15]。

從圖3可以看出，隨著壓力的增大，黃酮萃取率先顯著增大，然后逐漸趨于平緩。由Peng-Robinson狀態(tài)方程計算可知，50 ℃時，10 MPa下CO2的密度為 384.33 kg/m3。隨著壓力的不斷升高，超臨界CO2分子之間的距離不斷減小，其密度不斷增加， 20 MPa時CO2密度增加到784.29 kg/m3。當(dāng)萃取時間為120 min時，10 MPa壓力下的羅布麻黃酮萃取率為0.148%，而 20 MPa時羅布麻黃酮萃取率為0.337%，說明壓力對密度的影響極大影響著黃酮萃取率。另外壓力的增大可能還會破壞羅布麻纖維分子之間的連接，從而降低黃酮在羅布麻韌皮的傳質(zhì)阻力。雖然壓力升高會增大超臨界CO2分子間的相互作用，降低黃酮在流體中的擴(kuò)散，但密度效應(yīng)帶來的影響要大于擴(kuò)散效應(yīng)，因而壓力增大會提高黃酮萃取率。當(dāng)系統(tǒng)壓力繼續(xù)增大，超過一定值時，黃酮萃取率開始呈下降趨勢，這是由于高壓階段，由于擴(kuò)散效應(yīng)的影響，黃酮在超臨界流體及羅布麻韌皮內(nèi)的流動擴(kuò)散性降低了很多。當(dāng)壓力高于40 MPa時，萃取率可能會降低很多，但受設(shè)備限制，需在以后實驗中進(jìn)行驗證。

2.1.4CO2流量與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系

在50 ℃、20 MPa的萃取條件下，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液為助溶劑，流量為 0.6 g/min，分析CO2流量對黃酮萃取的影響，選擇流量范圍為 20～40 g/min，結(jié)果如圖4所示。

圖4 羅布麻黃酮萃取率與CO2流量的關(guān)系Fig.4 Relationship diagram of extraction rate of flavonoids from apocynum venetum and CO2 flow rate

從圖4可以看出：CO2流量為20 g/min時，在 20 MPa、50 ℃的操作條件下萃取120 min，羅布麻黃酮萃取率為0.284%；隨著CO2流量的增加，黃酮的萃取率逐漸增加。當(dāng)CO2流量增大到30 g/min時，黃酮萃取率提高了約20%。這是因為隨著CO2流量的增加，一方面加快了CO2在反應(yīng)釜中的流動速度，萃取出的黃酮能夠隨著CO2分子很快進(jìn)入分離釜，使黃酮在羅布麻韌皮和超臨界CO2流體中形成較高的濃度差，有效地提高了黃酮的擴(kuò)散系數(shù)，并且使更多的超臨界CO2分子與黃酮分子結(jié)合，增大了超臨界CO2攜帶黃酮分子的能力，進(jìn)而增大黃酮在CO2中的溶解[16]；另一方面會減少羅布麻表面黏性底層厚度，加快超臨界CO2分子在羅布麻表面的流動性，提高了黃酮萃取率。當(dāng)CO2流量繼續(xù)增大到 40 g/min時，萃取率僅增加了5.36%，但是流量增大意味著對設(shè)備要求的提高，并且對高壓泵的損傷也會加大。所以應(yīng)綜合考慮設(shè)備承受能力、成本和萃取率來選擇CO2流量。

2.1.5時間與羅布麻黃酮萃取的關(guān)系

超臨界CO2萃取羅布麻韌皮黃酮，按照萃取速率曲線可分為3個階段：1)初始快速萃取階段，在這一階段黃酮的萃取過程由黃酮在超臨界流體中的溶解度所決定，萃取速度比較恒定，并且萃取速度較快。從圖2看出，45 ℃黃酮的萃取速率要小于 40 ℃，這是由于45 ℃的超臨界CO2密度為 812.69 kg/m3，小于40 ℃的超臨界CO2密度為839.81 kg/m3，密度的大小決定了能夠溶解的黃酮的多少，從而影響此階段的萃取速率；2)萃取中間階段，在此過程中主要是破壞羅布麻纖維分子對黃酮的連接，所以呈現(xiàn)出的萃取速率比較低；3)黃酮擴(kuò)散緩慢萃取階段，即脫離束縛的黃酮分子由羅布麻韌皮內(nèi)部逐漸擴(kuò)散到表層。由圖1～4可以看出，120 min以后，黃酮的萃取率基本趨于平緩，也就是說此時黃酮的萃取速率很小，說明剩余的黃酮分子難以脫離纖維分子的束縛，擴(kuò)散過程也較慢，這也就決定了這一階段的萃取速率。

在超臨界CO2萃取羅布麻黃酮的過程中，初始階段由于羅布麻韌皮的破碎，超臨界CO2很容易把羅布麻表層自由狀態(tài)的黃酮以及受羅布麻纖維分子影響較小的黃酮萃取出來。隨著萃取的進(jìn)行，自由狀態(tài)的黃酮數(shù)量不斷減少，萃取率就不斷下降，直至萃取的完成。

2.2 黃酮成分的分離與檢測

按照1.5節(jié)方法利用高效液相色譜對萃取的黃酮進(jìn)行分離檢測，標(biāo)準(zhǔn)品及各萃取液的液相色譜圖如圖5所示。由圖5(a)所示的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、槲皮素和山柰酚的HPLC色譜圖可知，其在色譜柱中的保留時間分別為5.36、9.96、15.46 min。由圖5(b)所示的羅布麻原麻的乙醇萃取液色譜圖可知，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較，相同的保留時間出現(xiàn)的吸收峰代表了相同的物質(zhì)，羅布麻原麻萃取液中有較高的蘆丁和槲皮素，而山奈酚的吸收峰很小，說明山奈酚在羅布麻韌皮黃酮中的比例比較小。圖5(c)所示的羅布麻原麻的超臨界萃取液的色譜圖與圖5(b)所示的吸收峰的位置很相似，說明超臨界CO2可有效地將羅布麻韌皮中的黃酮成分萃取出來。由圖5(d)所示的傳統(tǒng)化學(xué)脫膠的羅布麻纖維乙醇萃取液色譜圖可知，仍然有蘆丁和槲皮素的吸收峰，說明脫膠后羅布麻纖維中仍含有一定的黃酮類物質(zhì)，但其含量降低了很多。其原因有以下2點：一是在脫膠過程中，黃酮隨著脫膠降解產(chǎn)物排放到了脫膠廢液中；二是在堿、酸和氧化劑的作用下，部分黃酮類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品及羅布麻萃取液液相色譜圖Fig.5 HPLC of standard products and lobulum extract. (a) Rutin, quercetin and kaempferol；(b) Ethanol extraction of apocynum venetum bast； (c) Supercritical fluid extraction apocynum venetum bast；(d)Ethanol extraction of apocynum venetum fiber

2.3 抗菌性分析

羅布麻韌皮、羅布麻纖維以及其乙醇萃取液和超臨界萃取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌性的實驗結(jié)果如表1所示?？芍S酮含量直接影響著其抗菌性能，黃酮含量高，其抗菌性就大。在黃酮含量相近的情況下，萃取液的抗菌效果要優(yōu)于麻皮及其纖維的抗菌性。羅布麻韌皮和韌皮的乙醇萃取液黃酮含量較高，對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為89.3%和88.7%，對大腸桿菌的抑菌率分別為93.6%和93.1%。而羅布麻纖維對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率僅為59.7%和62.5%。這是因為羅布麻韌皮在脫膠過程中，非纖維素成分在酸堿氧化劑的作用下不斷降解，使之與此相連的黃酮也與纖維素分子脫離，并排放到脫膠廢液中，從而降低了羅布麻纖維中的黃酮含量，進(jìn)而影響了羅布麻纖維的抗菌性能。羅布麻韌皮超臨界萃取液也具有較高的抗菌活性，可用于織物的抗菌整理。而羅布麻韌皮經(jīng)超臨界萃取后黃酮含量仍有0.56%，并且抗菌效果都在80%以上。由此說明黃酮類化合物是羅布麻纖維具有抗菌性能的原因之一。

表1 羅布麻及萃取液抗菌性Tab.1 Antibacterial activity of apocynum venetum extraction from apocynum venetum

3 結(jié) 論

1)本文利用超臨界CO2萃取了羅布麻韌皮纖維中的黃酮，當(dāng)助溶劑流量為0.6 g/min，溫度為 45 ℃、壓力為20 MPa，超臨界CO2流量為30 g/min時，萃取120 min羅布麻黃酮萃取率可達(dá)到0.362%。

2)經(jīng)高效液相色譜分析，羅布麻韌皮中黃酮成分主要為蘆丁和槲皮素，山柰酚的含量很低，脫膠后的羅布麻纖維中仍有少量的蘆丁和槲皮素。

3)在抗菌實驗中，羅布麻原麻和羅布麻纖維中黃酮含量分別為0.87%和0.10%，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌性分別為89.3%、93.6%、59.7%和61.8%，說明黃酮類化合物是羅布麻纖維具有抗菌性能的原因之一。