青海省海晏縣線葉嵩草內(nèi)生細菌的生物功能鑒定及測定

魏立娟， ， *，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學,甘肅 蘭州730070； 2.青海大學， 青海 西寧810003)

植物內(nèi)生細菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi)并與植物建立和諧關系的一類微生物[1-2]，隨著植物微生態(tài)系統(tǒng)研究的不斷深入，內(nèi)生細菌的存在和作用已得到廣泛共識[3]。幾乎所有的植物中都伴隨植物內(nèi)生細菌的存在，其長期生活于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中[4-5]，內(nèi)生細菌可利用風、土壤顆粒、水、農(nóng)業(yè)器具等多種外力條件和人類、鳥、昆蟲、線蟲等多種媒介從根際土壤定殖在寄主植物根內(nèi)部，具有溶磷、產(chǎn)生植物激素、固氮、合成鐵載體、誘導植物產(chǎn)生抗性、產(chǎn)生抗真菌代謝產(chǎn)物等多種生物功能[3]。王娜等[6]將內(nèi)生細菌接入棉花苗后再接種黃萎病菌，對黃萎病菌的防治效果可達79.52%～89.79%，有助于棉花病害的防治，為棉花增產(chǎn)提供有力幫助；杜曉寧等[7]研究表明枸杞可培養(yǎng)內(nèi)生細菌遺傳多樣性豐富，對植物病原菌有較強的抑制活性；蔡學清等[8]得出內(nèi)生細菌在寄主植物的定殖情況與其保鮮效果之間存在一定的正相關性，即內(nèi)生定殖是其達到保鮮效應的機制之一。植物內(nèi)生細菌也是重要的微生物農(nóng)藥來源[9]，目前在生物防治中具有很大潛力，也作為增產(chǎn)菌或潛在的生防載體菌而加以利用。

線葉嵩草(Kobresiacapillifolia) 是高寒草地牧區(qū)的優(yōu)勢牧草，不僅能適應惡劣的環(huán)境，還能為家畜提供優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)。崔月貞等[10]與高曉星等[11]對東祁連山牧草內(nèi)生細菌研究表明，其具有溶磷、固氮、產(chǎn)吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)作用。本試驗對青藏高原青海省線葉嵩草中內(nèi)生細菌的特性及其抗菌活性進行研究，以期其同樣具有溶磷、固氮、產(chǎn)IAA等能力，本研究以期明確青藏高原高寒草地線葉嵩草內(nèi)生細菌的多樣性和生物功能，為合理利用極端生境牧草提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 線葉嵩草采于2016年8月37°4′8″ N，100°52′42″ E的青海省海晏縣青海湖鄉(xiāng)，并對其根部進行分離得到內(nèi)生細菌。

1.1.2供試指示菌 馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrlchumcoccodes)，馬鈴薯枯萎病菌(Fusarlumavenaceum)，馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

1.1.3供試培養(yǎng)基 肉汁胨培養(yǎng)基(nutrient Ager，NA)用于內(nèi)生細菌分離、純化和保存等[12]；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato Dextrose Agar，PDA)用于植物病原真菌的培養(yǎng)和對峙實驗[13]；金氏(King)培養(yǎng)基用于產(chǎn)IAA的試驗；Pikovaskaia培養(yǎng)基(pikovaskaia’s，PKO)和蒙金娜培養(yǎng)基(Mehknha)分別用于溶解無機磷和有機磷試驗[14]，阿須貝無氮培養(yǎng)基(Ashby)用于篩選固氮菌[15]。

1.2 方法

1.2.1內(nèi)生細菌的分離純化 將線葉嵩草根部組織表面用清水清洗干凈，晾干后稱取2 g，表面消毒后置于無菌研缽中研碎，吸取植物組織研磨浸出液按10倍濃度梯度稀釋后，吸取0.1 mL涂布于NA培養(yǎng)基上，以最后一次洗滌水為對照，28℃培養(yǎng)3～7 d，根據(jù)菌落形態(tài)，顏色，大小，邊緣整齊度及表面形態(tài)等分類，純化后4℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2生物功能測定

1.2.2.1 拮抗能力測定

采用平板對峙法測定抑菌效果[17-19]，用直徑5 mm的打孔器取指示菌菌塊于PDA平板中央，在指示菌四周3 cm處接種供試菌，4次重復，將馬鈴薯壞疽病菌放于15℃培養(yǎng)，其余3個指示菌放于28℃培養(yǎng)。以不接種供試內(nèi)生菌為對照，待對照滿皿后測量菌落直徑，計算抑菌率[20]。

1.2.2.2 固氮能力測定

將純化得到的內(nèi)生細菌接種于NA液體培養(yǎng)基中，置于搖床28℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)所得到的菌懸液0.1 mL接種于阿須貝無氮平板和液體培養(yǎng)基中，以無菌水為對照，3次重復，平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，液體置于120 r·min-1震蕩培養(yǎng)，待第7天觀察，平板上有菌落或液體培養(yǎng)基變渾濁記為“+”，否則記為“-”。

1.2.2.3 溶磷能力測定

將活化的內(nèi)生細菌涂布于PKO(無機磷)和蒙金娜(有機磷)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)14天后觀察解磷圈，3次重復，根據(jù)解磷圈與菌落直徑比值大小確定其溶磷能力。

1.2.2.4 產(chǎn)IAA能力測定

采用Salkowski比色法[21]，分別在100 mg·L-1含色氨酸和不含色氨酸的金氏培養(yǎng)液中接種0.1 mL菌懸液[13]，加等量無菌水為對照，置于28℃，120 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)12 d，取50 μL菌懸液加入等量PC比色液，室溫靜置15 min后，觀察顯色反應，3次重復，全部變紅表明能產(chǎn)IAA，記為“+”，否則記為“-”。

1.2.3內(nèi)生細菌的鑒定

1.2.3.1 培養(yǎng)性狀觀察

將內(nèi)生細菌接種于NA培養(yǎng)基上，在28℃無光照條件下培養(yǎng)72 h，觀察內(nèi)生細菌菌落形態(tài)特征并描述和照相。

1.2.3.2 形態(tài)觀察

內(nèi)生細菌在NA平板上培養(yǎng)經(jīng)18～24 h革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體顏色和形態(tài)，并顯微拍照。

1.2.3.3 16S rDNA鑒定

以10株內(nèi)生細菌DNA為模板，使用細菌16S rRNA 基因通用引物進行擴增，擴增引物1為5'-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3'，引物2為5'-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，擴增體系包括25 μL 2×MasterMix，模板 2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL，總體積50 μL，PCR程序為：94℃預變性 4 min， 94℃變性30 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。獲得特異片段送到武漢金開瑞生物工程有限公司測序，并將序列上傳至NCBI 進行BLAST比對分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。用Maga 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學地位。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離純化

根據(jù)菌落大小、顏色、形態(tài)挑取不同單菌落，純化后從線葉嵩草根部分離出10株內(nèi)生細菌，分別編號為2G1、2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8、2G9和2G10保存?zhèn)溆?。對照沒有細菌菌落長出，說明表面消毒徹底，所得細菌均為內(nèi)生細菌。

2.2 生物功能測定

除2G1和2G10對4種指示菌均無拮抗作用外，其他8株內(nèi)生細菌對4種指示菌均有拮抗作用，其中對馬鈴薯炭疽病菌的拮抗作用最強，最強菌株是2G6，抑菌率達 88.58%， 2G8抑菌率最弱，也達66.98%，都顯著高于對其他菌株的抑菌率(P<0.05)。8株內(nèi)生細菌對番茄早疫病菌、馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病菌抑菌率介于32.59%～63.61%之間，其中2G5對番茄早疫病菌的抑菌率也較高為63.61%，(圖1，表1)。該結果表明，除2G1和2G10以外的8株內(nèi)生細菌均具有抑菌能力，具有良好的生物防治應用潛力。

圖1 2G9的抑菌作用Fig.1 The antagonism effect of 2G9

10株內(nèi)生細菌均能固氮，但無溶磷能力，2G1和2G10分泌IAA(表1)。該結果說明線葉嵩草根部內(nèi)生細菌具有功能多樣性。

2.3 內(nèi)生細菌的鑒定

2.3.1培養(yǎng)形狀觀察 從10株內(nèi)生細菌培養(yǎng)性狀看線葉嵩草內(nèi)生細菌在形態(tài)上存在多樣性(圖2)。

圖2 內(nèi)生細菌培養(yǎng)性狀Fig.2 Endophytic bacteria culture traits

表1 線葉嵩草內(nèi)生細菌的生物功能測定Table 1 Determination of biological functions of endophyte bacterium from Kobreais capillifolia

注：“+”：有功能；“-”無功能；同一行標不同字母表示在0.05水平差異顯著

Note: “+”:With biological function;“-”:Without biological function; Different lowercase letters within the same line mean significant difference among different treatments at the 0.05 level

2.3.2形態(tài)觀察 10株內(nèi)生細菌均為革蘭氏陽性菌，且均為桿狀，菌體差別明顯，2G10菌體最長，達20.29 μm，2G1菌體最寬，為1.60 μm，其他菌株長和寬均介于這兩者之間(圖3，表2)，表現(xiàn)出明顯的形態(tài)多樣性。

圖3 內(nèi)生細菌的革蘭氏染色Fig.3 Gram stain of endophytice bacteria from A.inebrians

表2 內(nèi)生細菌形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of endophytic bacteria

注：G+：革蘭氏陽性

Note: G+: Gram-positive bacteria

2.3.316S rDNA鑒定 所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列比對和構建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，10株內(nèi)生細菌都屬于芽孢桿菌屬，2G1和2G10分別與芽孢桿菌屬的Bacillusthuringiensis(KT965084.1)、Bacillussubtilis(JX994100.1)和Bacillussimpix(KF818620.1)一致性在99%以上，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步將其分別鑒定為芽孢桿菌屬的Bacillusthuringiensis和Bacillussimpix，2G2和2G9分別與Bacillusmethylotrophicus(KU877329.1、KM817258.1)的一致性在99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillusmethylotrophicus，2G3和2G6分別與Bacillusamyloliquefaciens(KU321524.1)的一致性在99%以上，并在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillusamyloliquefaciens，2G4和2G5分別與Bacillussiamensis(KC851838.1)的一致性達99%，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillussiamensis，2G7和2G8分別Bacillussubtilis.(KU551205.1、KU5563 29.1)一致性達99%以上，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，初步鑒定為Bacillussubtilis(圖3)。結合前文中的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征測定，將10株內(nèi)生細菌分屬于1個屬6個種，得出線葉嵩草根部內(nèi)生細菌在屬的種類上比較單一，但在種的水平上有很大差別。

3討論與結論

廣泛分布于青藏高原的高山草甸對密集放牧非常寬容，這些草地中的植物群落目前正在從莎草科向禾本科物種轉(zhuǎn)變，因此，正在進行的植物群落禾草替代將減少青藏高原矮嵩草甸[22]，減少青藏高原菌種資源。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應用潛力，是潛力巨大且尚待開發(fā)的微生物新資源[23]。Forchetti等[24]和Zhang等[25]認為具有固氮和分泌IAA能力的植物內(nèi)生細菌開發(fā)為生物菌肥有優(yōu)勢，本試驗分離得到的2G1和2G10同時具有固氮和分泌IAA的能力，能夠作為生物菌肥開發(fā)。崔月貞等[10]得出高寒草地優(yōu)勢牧草組織內(nèi)具有豐富的可分泌IAA的內(nèi)生細菌,且其中分泌IAA能力較強的菌株主要分布于線葉嵩草葉部和生長期的根部，但本試驗分離出的內(nèi)生細菌僅有2株具分泌IAA的能力，可能與不同地區(qū)線葉嵩草內(nèi)生細菌的差異有關，但具體原因仍要進一步研究。

馬鈴薯是我國較為重要的糧飼兼用作物，但是近年來報道的馬鈴薯病害日趨嚴重[26],本試驗分離所得內(nèi)生細菌除2G1和2G10以外，其余8株內(nèi)生細菌對馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和番茄早疫病菌都有較好的抑制作用，其中對馬鈴薯炭疽病的抑制效果最強，抑菌率分別為84.88%、84.57%、83.64%、85.80%、88.58%、86.11%、66.98%和82.41%，比崔月貞等[19]報道的最強抑菌率70.25%平均高13.07%，在馬鈴薯病害防治中展現(xiàn)出了巨大開發(fā)為生物制劑的潛力，為該菌能夠更好的在大田中防治馬鈴薯炭疽病，還需進一步研究其抑菌機制及發(fā)酵條件優(yōu)化等。此外本試驗還發(fā)現(xiàn)2G2、2G3、2G4、2G5、2G6、2G7、2G8和2G9具有固氮能力，該研究結果為開發(fā)藥肥兼用的微生物產(chǎn)品提供了菌種資源。

利用16S rDNA序列分析方法對內(nèi)生細菌進行鑒定得出，分離所得10株內(nèi)生細菌均為芽孢桿菌屬，與張芳芳等[27]研究所得結果芽孢桿菌屬是分離頻率最高的菌種相似。試驗中分離菌株均為芽孢桿菌屬的原因可能在于青海溫度低，其它菌株可能不能越冬，而芽孢桿菌抗逆能力強。此外本試驗僅利用16S rDNA序列分析方法對內(nèi)生細菌進行了鑒定，還需利用生理生化試驗及(G+C)%等進一步鑒定。