Sortilin促進肝癌細胞侵襲作用及機制研究

洪宏海,王 征,陳金桃

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 檢驗科(廣州510150)

肝癌是常見的惡性腫瘤，其致死率在腫瘤中排第3位[1]。肝癌的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，其具體分子機制尚未清楚[2]。大多數(shù)肝癌患者在診斷時已經(jīng)處于肝癌晚期，其生存期一般小于1年，且發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3]。肝癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的過程[4]。肝癌侵襲是肝癌遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，其與蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平密切相關(guān)[5]。肝癌早期診斷和治療可明顯提高肝癌病人的生存期和生活質(zhì)量[6]。目前,血清甲胎蛋白AFP是診斷肝癌的重要標(biāo)志物[7]。但是，AFP的靈敏性和特異性只有60%和80%左右[8]。因此，尋找其它血清標(biāo)志物輔助或聯(lián)合AFP對肝癌診斷尤為重要。

Sortilin蛋白于1997年在人腦提取物中被發(fā)現(xiàn)，隨后研究[9]發(fā)現(xiàn)其基因定位于人1號染色體，編碼833個氨基酸，其分子量約為100 KD。Sortilin蛋白屬于Vps10p結(jié)構(gòu)域家族受體，為單跨膜受體,研究[10]發(fā)現(xiàn)其參與神經(jīng)營養(yǎng)因子胞內(nèi)分選及老年癡呆疾病發(fā)病。有研究[11]發(fā)現(xiàn)Sortilin蛋白在很多組織中表達，如大腦、脊髓、舉丸、甲狀腺、心臟和骨豁肌等。Sortilin蛋白與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切聯(lián)系，如促進腎癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、卵巢癌細胞增殖；Sortilin促進腎癌、乳腺癌侵襲及惡性[12]。但是，Sortilin蛋白在肝癌中的作用尚未清楚。在本研究中利用MTT法和Invasion assay研究Sortilin對肝癌的增殖和侵襲作用，并探討其分子機制；同時用ELISA方法檢測肝癌病人血清中Sortilin水平，分析其與AFP的相關(guān)性。此外，ROC曲線分析血清中Sortilin在肝癌診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與標(biāo)本收集

HepG2細胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所方淑環(huán)教授贈予。健康人和肝癌病人血清來自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院體檢中心和檢驗科。所有病人資料和標(biāo)本收集都嚴格按照廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑和耗材

Sortilin ELISA檢測試劑盒購自CUSABIO公司。AFP ELISA檢測試劑盒購自安圖生物公司。小分子干擾RNA-Si-Sortilin購自銳博公司。MMP-2和MMP-9一抗購自CST公司。MTT購自北京鼎國公司。細胞培養(yǎng)皿購自康寧公司。Transwell小室購自BD公司。

1.3 Sortilin干擾小片段構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

Sortilin干擾小片段購自銳博公司。Si-Sortilin片段序列及轉(zhuǎn)染步驟見文獻[13]。Sortilin干擾小片段干擾序列為：5'-CUCUGCUGUUAACAC CACC[dT][dT]-3'。轉(zhuǎn)染步驟：HepG2細胞接種于6孔板中，待其融合度為60%左右，用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000轉(zhuǎn)染 Si-Sortilin片段，6 h后換液，24 h后進行MTT和Invasion assay實驗或收集蛋白進行后續(xù)檢測分析。

1.4 MTT法檢測肝癌細胞增殖能力

取對數(shù)生長期肝癌細胞，接種到48孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 mL細胞懸液，置于37℃、5%CO2cell incubator中培養(yǎng)；細胞貼壁后其融合度達到60%左右，瞬時轉(zhuǎn)染Sortilin干擾小片段Si-Sortilin，不同時間點(24、48、72 h)加入200 μL的MTT工作液(濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；去掉上清后每孔加入2 mL二甲基亞砜，用搖床震蕩搖勻，以使藍色結(jié)晶顆粒甲纘完全溶解，用酶標(biāo)儀測定OD570的光密度值。實驗中每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)的培養(yǎng)孔，重復(fù)進行3次。

1.5 Western blot檢測蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平

收集處理好的HepG2細胞，加入裂解液，蛋白定量后進行蛋白電泳。電轉(zhuǎn)后用5%脫脂牛奶封閉1 h，PBS洗3次，加入MMP-2和MMP-9一抗，4 ℃過夜，TPBST洗3次后加入二抗孵育1 h，然后TBST洗3次，最后加入ECL顯色，拍照。

1.6 Invasion assay檢測肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力

Invasion assay是用Boyden transwell小室來進行的。在進行Invasion assay實驗前將Boyden transwell小室水化3 h，按照1∶3的比例用DMEM稀釋matrixgel，然后吸取60 μL稀釋后的matrixgel平均鋪入Boyden transwell小室，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。細胞種植到6孔板中，等細胞融合度到達60%時，瞬時轉(zhuǎn)入Sortilin干擾小片段Si-Sortilin，24 h后消化細胞；將消化的細胞置于15 mL離心管中，用無血清的培養(yǎng)液配制成一定濃度細胞懸液。于24孔板中先加入500 μL含有10%血清的培養(yǎng)液，把鋪好matrixgel的transwell小室放到24孔板中，使transwell小室底端剛好接觸到下面的培養(yǎng)液。以每孔加入1×105個細胞加入transwell小室的上室。在不同時間點取出transwell小室，用4%的多聚甲醛固定15 min。然后進行結(jié)晶紫染色30 min，用清水輕輕洗去多余結(jié)晶紫染液，用棉簽小心擦去transwell小室里面的細胞，然后室溫晾干，使用顯微鏡觀察transwell小室外面細胞并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Sortilin對肝癌細胞株HepG2生長作用

MTT檢測Sortilin對肝癌細胞增殖作用。轉(zhuǎn)染Sortilin干擾小片段Si-Sortilin后，在不同時間點24、48、72 h進行MTT實驗。結(jié)果顯示：與對照組相比，干擾Sortilin組肝癌細胞生長并沒有受到影響(P>0.05)，表明Sortilin不影響肝癌細胞HepG2增殖(圖1)。

圖1 MTT法檢測Sortilin對肝癌細胞株HepG2生長的作用

2.2 肝癌病人血清Sortilin水平升高且對肝癌診斷具有較好價值

Sortilin可分泌到血清中，且其可能作為心血管疾病和糖尿病診斷的血清標(biāo)志物。用ELISA試劑盒檢測血清中Sortilin水平,結(jié)果顯示，與對照組相比，肝癌病人血清中Sortilin水平明顯高于健康人(圖2A)。此外，為了驗證血清Sortilin對肝癌病人的診斷價值，本實驗還進行了ROC曲線分析。結(jié)果顯示，AUC面積為0.862，表明血清Sortilin水平對肝癌的診斷具有較好價值。同時ROC曲線分析表明血清Sortilin對肝癌診斷敏感性和特異性分別為77.1%和71.4%；其診斷的cut-off值為1 947.5，95%置信區(qū)間為0.776～0.947(圖2B)。

圖2 Sortilin在肝癌病人血清中水平及其ROC曲線分析

2.3 Sortilin促進肝癌細胞株HepG2侵襲

HepG2細胞轉(zhuǎn)染干擾Sortilin的小分子干擾片段后進行Invasion assay實驗。結(jié)果顯示: 與對照組相比，HepG2組胞轉(zhuǎn)染Sortilin小分子干擾片段后，侵襲穿過Transwell小室的細胞明顯減少，表明干擾Sortilin后明顯抑制肝癌細胞株HepG2侵襲能力(圖3)。

圖3 Invasion assay 檢測Sortilin對肝癌細胞株HepG2侵襲作用(400X)注：A：對照組；B：干撓Sortilin組

2.4 干擾Sortilin后下調(diào)蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平

為了研究Sortilin促進肝癌細胞侵襲作用的分子機制，用Western blot檢測干擾Sortilin后蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平。蛋白電泳結(jié)果顯示，在肝癌細胞HepG2中干擾Sortilin后，蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平明顯下調(diào)，提示Sortilin可能調(diào)控MMP-2和MMP-9水平促進肝癌細胞侵襲(圖4)。

圖4 Western blot檢測HepG2細胞干擾Sortilin后蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9蛋白水平

2.5 肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相關(guān)

甲胎蛋白AFP是肝癌診斷重要指標(biāo)之一。為了進一步探討Sortilin與肝癌診斷的關(guān)系，本實驗檢測35例肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平(圖 4A、5A)，然后進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5B)。

圖5 肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平呈正相關(guān)注：A：ELISA法檢測肝癌病人血清AFP水平；B：肝癌病人血清Sortilin水平和AFP水平相關(guān)性分析

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中排名前列[13]。肝癌的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，遠處轉(zhuǎn)移是其惡性特征之一[14]。隨著手術(shù)和藥物發(fā)展，肝癌治療雖然取得一定進展，但是效果不佳，其主要原因是耐藥或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默Sortilin后明顯抑制肝癌細胞的侵襲能力，且下調(diào)蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平。進一步研究表明肝癌病人血清中也存在Sortilin蛋白，且對肝癌的診斷具有較好價值。此外，肝癌病人血清Sortilin蛋白與肝癌標(biāo)志物AFP呈正相關(guān)。

研究[16-17]表明其與心血管疾病、老年癡呆、腫瘤密切相關(guān)。但是，Sortilin在肝癌中作用尚未清楚。有研究[18]報道Sortilin作為輔助受體，調(diào)控proBDNF誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡。因此，我們首先用MTT法檢測Sortilin對肝癌細胞生長作用，結(jié)果表明其并不影響肝癌細胞HepG2生長，表明在不同種類細胞中，Sortilin對不同種類細胞生長作用并不一樣，這種不同作用的分子機制尚未清楚。在腫瘤中，Sortilin可促進乳腺癌、結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們下一步研究Sortilin對肝癌侵襲作用。侵襲實驗表明，沉默Sortilin后，肝癌細胞的侵襲能力明顯受到抑制。本實驗結(jié)果提示，Sortilin在腫瘤侵襲中起著重要作用，可能成為治療腫瘤的潛在靶點。蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9與腫瘤侵襲密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明：沉默Sortilin后明顯抑制MMP-2和MMP-9水平，Sortilin通過調(diào)控MMP-2和MMP-9水平，進而調(diào)控肝癌細胞的侵襲。

Sortilin蛋白不僅作為受體存在于細胞膜上，也可分泌到血清中，且其對心血管疾病診斷具有良好價值[19]。為了闡明血清中Sortilin蛋白與肝癌的關(guān)系，我們收集了35例肝癌病人血清和健康人血清，ELISA法檢測其水平。結(jié)果顯示肝癌病人血清中Sortilin含量明顯高于健康人對照組。但是，Sortilin蛋白是如何分泌入血清中尚未清楚，值得我們進一步研究。此外，ROC曲線表明血清Sortilin對肝癌具有較好的診斷價值。這些結(jié)果表明Sortilin不僅僅影響肝癌侵襲能力，還可分泌到血清中，且有可能成為肝癌診斷的潛在標(biāo)志物。

AFP是肝癌診斷的重要指標(biāo)之一。但是，在許多疾病中AFP水平也升高，AFP在肝癌診斷中特異性僅為80%[20]。本研究表明：血清中Sortilin含量與AFP含量密切聯(lián)系，呈正相關(guān)(P<0.001)，提示肝癌血清中Sortilin可輔助或聯(lián)合AFP，提高肝癌診斷和疾病監(jiān)測。

綜上所述，本研究證明Sortilin通過調(diào)控蛋白金屬酶MMP-2和MMP-9水平，進而調(diào)控肝癌細胞的侵襲；此外，血清中Sortilin含量與AFP呈正相關(guān)，且對肝癌診斷具有一定的價值。