以藥測(cè)證法對(duì)大鼠寒凝血瘀證關(guān)鍵證素的研究

徐小薈，熊麗輝

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

寒凝血瘀證主要原因是寒邪侵襲，損傷陽(yáng)氣；寒性凝滯，陽(yáng)虛不運(yùn)，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，瘀血內(nèi)生，從而形成寒凝血瘀證。寒凝血瘀證是臨床中血瘀證常見(jiàn)的亞型之一，存在于多種疾病中[1-6]，多涉及內(nèi)、外、婦、兒、腫瘤等各科疾病，尤其以東北寒冷的氣候條件下，該證較多。臨床以冷痛、腫塊、顏色紫暗、脈沉遲或沉澀等為主要表現(xiàn)，治療以溫陽(yáng)活血行氣為主，但三者的權(quán)重鮮有提及。在健康需求日益提高的今天，人們的要求不僅是治好病，而是要以最小的投入獲得最大的治療效果。為此，本研究以證素的權(quán)重為切入點(diǎn)，探討寒凝血瘀證的關(guān)鍵病機(jī)，為準(zhǔn)確治療提供依據(jù)。

藥物的篩選以古籍整理的結(jié)果為線索，通過(guò)對(duì)《中華醫(yī)典》（5版）的檢索，篩選出治療寒凝血瘀證的高頻藥物，前3味藥物分別為：附子（溫陽(yáng)）、當(dāng)歸（活血）、香附（行氣）；以3味藥及其不同組合對(duì)大鼠寒凝血瘀證的不同療效，從而判斷寒凝血瘀證的關(guān)鍵證素。

1 材料與方法

1.1 藥物 當(dāng)歸、香附、附子藥物均購(gòu)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院農(nóng)本方顆粒藥房。將藥物分別加10倍量沸水浸泡，制成1 g/mL生藥量，自然涼后置于冰箱保存[2]。1.2 動(dòng)物 Wester雌性大鼠60只，體質(zhì)量（200±10）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。在長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫22～25 ℃。1.3 方法

1.3.1 分組 大鼠隨機(jī)分為6組，分別是正常對(duì)照組、病理模型組、附子組、香附附子組、當(dāng)歸香附組、香附當(dāng)歸附子組，每組10只。

1.3.2 造模方法 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)的病因病機(jī)冷凍致寒凝建立寒凝血瘀證的動(dòng)物模型[7-8]。正常對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，其他組均采用冰水冷凍法造模[9-10]，每天（于每晚6: 00 — 7: 00）將大鼠全身置于0 ℃冰水中10 min，持續(xù)刺激30 d，直到大鼠出現(xiàn)明顯“寒凝血瘀”表征，每早8: 00去觀測(cè)大鼠的活動(dòng)度、飲水量、心率、二便情況等，具體表現(xiàn)為：蜷縮少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、喜扎堆、呼吸微弱、唇周發(fā)黑、耳色暗紅、爪尾部紫暗、舌暗紅、被毛蓬松豎立無(wú)光澤、心率減慢、飲水量少、小便色清、大便濕爛等癥狀；出現(xiàn)蜷縮少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、皮毛無(wú)光澤、耳廓紫暗或紫黑、皮膚呈現(xiàn)青紫瘀斑等癥狀，確定造模成功（該寒凝血瘀模型為感寒致瘀的實(shí)證模型）[11]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 所有大鼠進(jìn)行3 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)，第3天測(cè)量每組大鼠體質(zhì)量，第4天開(kāi)始造模，每天（于清晨7: 00—8: 00）對(duì)大鼠進(jìn)行觀測(cè)，觀察大鼠的狀態(tài)、皮毛顏色、耳廓顏色、爪甲顏色、二便情況；測(cè)量大鼠的活動(dòng)度、飲水量、心率，活動(dòng)度以cm為單位，測(cè)量時(shí)間為15 s，每早8: 00把每組灌滿水的水瓶進(jìn)行稱重，晚上6: 00再進(jìn)行稱重，每天把早晚水瓶的重量做差；心率每天7: 30進(jìn)行測(cè)量，做好記錄。每天（于每晚6: 00—7: 00）將大鼠全身置于0 ℃冰水造模實(shí)驗(yàn)，除正常組大鼠不進(jìn)行冰泳造模外，其他6組大鼠都進(jìn)行冰泳造模實(shí)驗(yàn)，將大鼠全身置于0 ℃冰水中10 min，持續(xù)刺激30 d，觀測(cè)大鼠10 d后逐漸出現(xiàn)寒凝血瘀表征，測(cè)量每組大鼠活動(dòng)度、飲水量、心率，30 d后大鼠寒凝血瘀證的表征明顯，表明造模成功。造模成功后的第2天對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃（除正常組與病理組外），第3組大鼠用附子灌胃，第4組用附子當(dāng)歸灌胃，第5組用附子香附灌胃，第6組用附子當(dāng)歸香附灌胃。每天早晚7: 00進(jìn)行灌胃1次，持續(xù)15 d，觀察各個(gè)不同給藥組大鼠的表征變化及量化指標(biāo)的改變。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo) 觀察并測(cè)量表征指標(biāo)及量化指標(biāo)的變化，包括大鼠活動(dòng)度、皮毛色澤、毛發(fā)形態(tài)、耳廓邊緣血管顏色、爪子顏色、二便、舌質(zhì)顏色、心率、飲水量、TNF-α、IL-1β 等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用χ2分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模前后定量表征情況比較 從活動(dòng)度、皮毛色澤、周身有無(wú)紫斑、耳廓顏色等幾個(gè)方面進(jìn)行定量及定性評(píng)價(jià)。其中，活動(dòng)度以每次在大鼠籠里（545 cm×395 cm×200 cm）的爬行距離（cm）為指標(biāo)，每天測(cè)量3次取平均值；皮毛光澤分有光澤（皮毛光亮柔順）、少澤（毛色暗，尚柔順）、無(wú)光澤（毛色暗滯，成穗）3個(gè)等級(jí)；檢測(cè)每只大鼠心率取平均值；定性指標(biāo)的判斷以每組發(fā)生率在60%以上者為陽(yáng)性，用“有”“無(wú)”描述。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大鼠造模前后定量表征情況比較（x± s ，n = 10）

第1天2組在活動(dòng)度、心率、飲水量、耳廓顏色方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第15、30天2組在活動(dòng)度、心率、飲水量方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明造模成功。

2.2 各組大鼠給藥后定量表征情況比較 見(jiàn)表2。

2.3 大鼠給藥結(jié)束后各組TNF-α、IL-1β情況比較 見(jiàn)表3。

3 討論

寒凝血瘀證是由于寒邪所引起的血脈不通、血行遲緩澀滯、血液壅阻于脈中或離經(jīng)停聚的病理狀態(tài)，表現(xiàn)為“血凝而不流，氣血不至，血不歸經(jīng)，血瘀滯不行，血泣不通”，是多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)或病變結(jié)果，并且也成為了近代醫(yī)學(xué)研究活躍的領(lǐng)域之一[12-13]。

寒凝血瘀證在胸痹中出現(xiàn)的比率相對(duì)較高，許多學(xué)者[14-20]認(rèn)為，西醫(yī)的急性冠脈綜合征屬于中醫(yī)的胸痹心痛，為本虛標(biāo)實(shí)證，其中血瘀為主要標(biāo)實(shí)證，血清中TNF-α、IL-1β參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，值的高低與寒凝血瘀證的輕重有密切聯(lián)系，寒凝血瘀證越重TNF-α、IL-1β的值越高，反之越低。

表2 各組大鼠給藥后定量表征情況比較（x± s ，n = 10）

表3 大鼠給藥結(jié)束后各組TNF-α、IL-1β情況比較（x± s ，n = 10）

從實(shí)驗(yàn)中大鼠的表征和TNF-α、IL-1β值的高低來(lái)看，單味藥附子對(duì)大鼠的各個(gè)表征緩解效果最佳，TNF-α、IL-1β值最低，其次是附子香附組。因此，溫陽(yáng)、行氣、活血三法中，應(yīng)重用溫陽(yáng)，或者可以理解為溫陽(yáng)單法可能替代三法同用的效果，對(duì)臨床中減少不必要的投入提供了有益的啟示，說(shuō)明寒凝血瘀證的關(guān)鍵證素為陽(yáng)虛。結(jié)合《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論》的論述：“氣血者，喜溫而惡寒，寒則泣而不行，溫則消而去之”，由此也說(shuō)明溫陽(yáng)對(duì)治療寒凝血瘀證的重要性，這些研究結(jié)果能夠?yàn)榕R床準(zhǔn)確辨證提供有力的依據(jù)。本研究結(jié)果也為臨床不必要的投入提供了依據(jù)，為小投入大收益的健康治療原則研究探索了思路。