不同時(shí)間煎煮柴胡對五柴胡飲中柴胡皂苷含量及藥效學(xué)的影響

辛 國，趙昕彤，李 文，李 鑫，葉豆丹，黃曉巍,3*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；3.吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130117）

五柴胡飲始載于《景岳全書》：“柴胡1～3錢，當(dāng)歸2～3錢，熟地3～5錢，白術(shù)2～3錢，白芍半錢，炙甘草1錢，用于中氣不足，外邪不散；傷寒，瘧疾，痘瘡”[1]。柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根，性微寒、味辛苦，具有疏散退熱、疏肝解郁等功效[2]。早于明代陶華所著《傷寒六書》中就有對柴胡入湯劑宜先煎的相關(guān)記載：“一用和解藥，先煎柴胡一二沸，后入余藥同煎”[3]?，F(xiàn)代研究表明，柴胡的有效成分主要為三萜皂苷類物質(zhì)柴胡皂苷，不易煎出，故認(rèn)為柴胡入湯劑宜先煎，但在《中華人民共和國藥典》（2015版）中并未對其做出明確闡述[4]。本文現(xiàn)通過觀察柴胡先煎時(shí)間對五柴胡飲中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量變化及藥效學(xué)的影響，明確五柴胡飲中柴胡先煎的最佳時(shí)間，為柴胡的特殊煎煮方法在臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 ICR小鼠，SPF級，雌性180只，雄性60只，體質(zhì)量18～22 g，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（吉）2016-0003。

1.2 主要藥物試劑與儀器 柴胡皂苷a對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號B20146；柴胡皂苷d對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號B20150；感冒疏風(fēng)片，吉林龍鑫藥業(yè)有限公司，批號151008100；去痛片，長春大政藥業(yè)科技有限公司，批號161235；枸櫞酸噴托維林片，天津力生制藥股份有限公司，批號1611014.08。LC-2030島津高效液相色譜儀（日本島津公司），MS205DU十萬分之一天平（梅特勒-托利多集團(tuán)），DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），YSH-A15W6煎藥壺（廣東小熊電器有限公司）。

2 化學(xué)試驗(yàn)

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg，柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，稀釋成含柴胡皂苷a 0.8 mg/mL，柴胡皂苷d 1 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 稱取柴胡30 g，加500 mL水浸泡30 min，另取熟地黃30 g，白術(shù)20 g，當(dāng)歸20 g，白芍5 g，炙甘草10 g。加500 mL水浸泡30 min，分別將柴胡先煎0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，9個(gè)煎煮時(shí)間的五柴胡飲濃縮干燥（80 ℃）至干膏（出膏率約為13.91%）研磨成粉末（過4號篩），取該粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入5%濃氨水甲醇溶液25 mL，于30 ℃水溫超聲提取0.5 h，放冷，過濾，用20 mL甲醇分2次洗滌容器和藥渣，合并濾液，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓⒍ㄈ莩?5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得9種不同煎煮時(shí)間的柴胡供試品溶液。

陰性對照組溶液的制備[5]。取約熟地黃30 g，白術(shù)20 g，當(dāng)歸20 g，白芍5 g，炙甘草10 g。加500 mL水浸泡30 min，煎煮20 min，按上述方法制備即得。2.3 色譜條件 色譜柱：INERTSIL ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水梯度洗脫（0～50 min，乙腈濃度由25% 升至90%，50～55 min，乙腈濃度為90%），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL。在選定的色譜條件下，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于10 000，拖尾因子符合要求。2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取柴胡皂苷α標(biāo)準(zhǔn)品8.00 mg、柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用甲醇定容至10 mL[6-8]。以此液為母液，分別精密移取，制成濃度分別為柴胡皂苷α濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，柴胡皂苷d的濃度為0.125 、0.25 、0.5、0.75、1 mg/mL的溶液，依2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以濃度 X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出柴胡皂苷α的回歸方程為：

柴胡皂苷d的回歸方程為：

結(jié)果表明，柴胡皂苷α在濃度為0.1～0.8 mg/mL、柴胡皂苷d在濃度為0.125～1 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1項(xiàng)下制備的對照品溶液10 μL，進(jìn)行液相檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次。得到柴胡皂苷α的RSD（n = 6）為0.79%，柴胡皂苷d的RSD（n = 6）為0.96%，結(jié)果表明，儀器精密度良好[9-10]。2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在 0、4、8、12、24、48 h精密吸取室溫下放置的2.2項(xiàng)下柴胡先煎15 min的樣品溶液10 μL，進(jìn)樣測定。以峰面積積分值為指標(biāo)測定其穩(wěn)定性，柴胡皂苷α的RSD（n = 6）為0.71%，柴胡皂苷d的RSD（n = 6）為0.93%。表明五柴胡飲中的柴胡皂苷α和柴胡皂苷d在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[11]。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)下煎煮6份柴胡先煎15 min的五柴胡飲，并進(jìn)行樣品處理，每份精密吸取10 μL進(jìn)行檢測。以回歸方程計(jì)算柴胡皂苷α和柴胡皂苷d的含量，其平均值（n = 6）為34.69 mg/mL，RSD （n = 6）為 0.027%[12]。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量為34.25 mg/mL的柴胡先煎15 min五柴胡飲浸膏6份，每份約0.1 g，分別加入相當(dāng)于樣品中柴胡皂苷α、柴胡皂苷d含有量100%的柴胡皂苷α和柴胡皂苷d對照品粉末。按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL測定。得到加樣回收率為100.3% ，RSD（n = 6）為1.143%[13]。

2.4.6 樣品含量測定 分別吸取2.2項(xiàng)下9個(gè)煎煮時(shí)間的五柴胡飲，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測定。9個(gè)樣品中柴胡皂苷α和柴胡皂苷d的含量分別為：18.29、22.10、31.67、34.25、30.52、23.69、18.31、15.30、13.43 mg/g。

3 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.1 藥物制備 五柴胡飲的制備：稱取柴胡60 g，加500 mL水浸泡30 min，另取熟地黃60 g，白術(shù)40 g，當(dāng)歸40 g，白芍10 g，炙甘草20 g。加500 mL水浸泡30 min，依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮，并濃縮至含柴胡濃度為1 g/mL，放涼，備用[14]。

陽性藥的制備：去痛片的制備，取藥品粉末11.150 g，用水50 mL制成濃度為0.230 g/mL溶液備用。枸櫞酸噴托維林片的制備，取藥品粉末0.570 g，加水50 mL制成濃度為0.011 4 g/mL溶液備用。感冒疏風(fēng)片的制備，取藥品粉末40.00 g，加水50 mL，制成濃度為0.800 g/mL溶液備用。

3.2 動物分組及給藥 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，120只雌鼠隨機(jī)分為12組，每組10只，即模型對照組，感冒疏風(fēng)片組，去痛片組，不同煎煮時(shí)間的五柴胡飲9組（依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮）。鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)120只小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為12組，每組10只，即模型對照組，感冒疏風(fēng)片組，枸櫞酸噴托維林片組及不同煎煮時(shí)間的五柴胡飲9組（依2.2項(xiàng)下時(shí)間要求進(jìn)行煎煮）。按0.02 mL/g劑量對各組小鼠灌胃給藥，模型對照組給予等體積的純凈水，連續(xù)給藥7 d。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，2組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn) 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)各組小鼠（雌雄各半）末次給藥1 h后，將小鼠放入霧化器中，以25%氨水定量噴霧引咳，記錄各組小鼠的咳嗽潛伏期（首次咳嗽的時(shí)間）和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)[15]。結(jié)果見表1。

表1 不同時(shí)間煎煮柴胡的五柴胡飲對小鼠的鎮(zhèn)咳作用（x± s ，n = 10）

3.5 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)各組小鼠（雌性）末次給藥1 h后，將小鼠置于（55±0.5）℃的智能熱板儀上，記錄其足底接觸熱板到出現(xiàn)舔后足或跳躍的時(shí)間[16]。結(jié)果見表2。

表2 不同時(shí)間煎煮柴胡的五柴胡飲對小鼠的鎮(zhèn)痛作用（x± s ，n = 10） s

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五柴胡飲中的柴胡皂苷含量隨煎煮時(shí)間延長而逐漸增加，至柴胡煎煮35 min（即先煎15 min）時(shí)候含量最大，之后隨煎煮時(shí)間延長柴胡皂苷含量降低。可能原因主要為：隨著煎煮時(shí)間改變，柴胡各有效成分之間可能產(chǎn)生分解反應(yīng)、聚合反應(yīng)等，也可能發(fā)生了有效成分之間的轉(zhuǎn)化。藥效學(xué)結(jié)果表明，與模型對照組相比，柴胡先煎15 min組小鼠的痛閾時(shí)間存在顯著性差異（P＜0.01），柴胡先煎10、20、25 min組的痛閾時(shí)間明顯延長（P＜0.05）；柴胡先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），其中煎煮35 min組的鎮(zhèn)咳效果最為顯著。結(jié)果表明，五柴胡飲中柴胡皂苷的含量與柴胡的煎煮時(shí)間有關(guān)，且柴胡皂苷的含量變化直接影響了五柴胡飲的鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛的作用。綜上所述，柴胡入湯劑宜先煎，最佳煎煮時(shí)間為35 min（即先煎15 min）。